青島文昌魚AmphiTCTP，AmphiG10及核糖體蛋白基因的研究.pdf

1、文昌魚(Amphioxus)屬于文昌魚綱-頭索動物亞門僅有的一個綱，現(xiàn)存動物僅29種左右。分布于我國的文昌魚主要是白氏文昌魚(BranchiostomabelcheriGray)，分為青島亞種和廈門亞種。 文昌魚的傳統(tǒng)分類地位比較特殊，在生物進化中占有重要的地位。文昌魚是否是最接近于脊椎動物的無脊椎動物，存在著兩種不同的觀點。 一種觀點認(rèn)為，文昌魚是全世界現(xiàn)存動物中最接近于脊椎動物的無脊椎動物，脊椎動物的祖先生物可能與文

2、昌魚類似。支持這一觀點的人居多，主要依據(jù)是：首先，從結(jié)構(gòu)上、形態(tài)上文昌魚更像魚，文昌魚的身體構(gòu)造和脊椎動物非常相似，具有脊索、神經(jīng)管、咽鰓裂等脊索動物的三大基本特征，而且還有體節(jié)和肌節(jié)。其次，對文昌魚神經(jīng)內(nèi)分泌和生殖內(nèi)分泌的研究也支持這種觀點，文昌魚的哈氏窩(Hatschek'spit)是文昌魚的高級內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中樞，與脊椎動物下丘腦的內(nèi)分泌功能類似。再次，對文昌魚基因進化的許多研究也支持這一觀點。文昌魚AmphiD1/beta，HOX1

3、，HOXb1，HOX3等基因與脊椎動物的同源基因同源性很高，功能上亦有很大的相似性。 另一種觀點認(rèn)為，文昌魚不是與脊椎動物祖先生物最接近的動物，尾索動物即被囊動物更接近于脊椎動物的祖先。支持這一觀點的認(rèn)為“從基因組研究看來，脊椎動物的祖先是被囊類動物(tunicates)，而不是文昌魚(Amphioxus)。被囊類動物更接近于脊椎動物；文昌魚既不接近于被囊動物，也不接近于脊椎動物，而是更接近于棘皮動物(echinoderms)。

4、”上述兩種觀點雖然不同，但有一點是相同的，即都希望通過基因進化的研究確定脊椎動物的起源。因此，積極開展文昌魚基因進化的研究是很有必要的。 近些年來我們主要開展了文昌魚發(fā)育分子機制的研究，發(fā)現(xiàn)了一批與文昌魚胚胎發(fā)育調(diào)控機制有關(guān)的基因，包括：Hedgehog，AmphiCKS1，AmphiSom,AmphiMdp，profilin，GABARAPL2,AmphiHMGB，thymosin-beta4等。本研究將報道的AmphiTCT

5、P,AmphiG10基因和文昌魚核糖體蛋白基因也是這項研究工作的一部分。 TCTP基因是翻譯控制腫瘤蛋白(translationallycontrolledtumourprotein，TCTP)的編碼基因。TCTP蛋白又稱P21，Q23或P23最早被認(rèn)為是一個腹水瘤相關(guān)蛋白，后來發(fā)現(xiàn)TCTP同源基因在絕大多數(shù)哺乳動物的腫瘤組織、正常組織和細(xì)胞系中均有表達(dá)。TCTP在細(xì)胞生長、細(xì)胞周期運行、癌變、抗凋亡、甚至在過敏性鼻炎、哮喘、先

6、天性慢性風(fēng)疹有重要作用。TCTP也是一種組織胺釋放因子，并可與微管蛋白和鈣離子結(jié)合。 通過建文昌魚神經(jīng)胚cDNA文庫和規(guī)?；瘻y序，我們篩選到編碼TCTP同源的文昌魚TCTP，此cDNA全長697bp，閱讀框位于35-544bp，由510核苷酸組成，所編碼169aa的TCTP蛋白。blast分析表明，此cDNA的演繹蛋白與其他物種的TCTP有很高的同源性，同源性在40﹪-57﹪之間。其他物種的TCTP蛋白含有兩個特征性氨基酸序列T

7、CTP1和TCTP2，本研究發(fā)現(xiàn)文昌魚TCTP同樣含有TCTP1和TCTP2特征性氨基酸序列，分別處于46-56和126-148氨基酸序列段，因此，命名該基因為AmphiTCTP(GenBankaccessionnumber：AF397146)。系統(tǒng)進化樹分析顯示，AmphiTCTP演繹蛋白在進化上是相當(dāng)保守的。AmphiTCTP演繹蛋白更接近于脊椎動物TCTP，其進化枝在脊椎動物TCTP進化枝基部分開，顯示文昌魚TCTP基因的進化性與

8、文昌魚在動物的系統(tǒng)分類中的進化地位相一致。通過整裝原位雜交技術(shù)和切片技術(shù)對文昌魚胚胎發(fā)育不同時期體內(nèi)AmphiTCTP表達(dá)狀況進行了研究，結(jié)果顯示AmphiTCTP在受精卵和早期分裂球中有表達(dá)，在進入囊胚和原腸胚時期未見表達(dá)。但在受精后10h發(fā)育的早期神經(jīng)胚的背中部重新表達(dá)。切片觀察顯示表達(dá)區(qū)位于正在分化的體軸和近旁中胚層。隨著胚胎的發(fā)育，AmphiTCTP在預(yù)定脊索中胚層、預(yù)定體節(jié)中胚層和初生的體節(jié)中表達(dá)。但隨著脊索和體節(jié)的形成，Am

9、phiTCTP在這些區(qū)域的表達(dá)將下降。在外胚層和內(nèi)胚層及其形成的組織中未見AmphiTCTP的表達(dá)。AmphiTCTP的這種隨著文昌魚胚胎發(fā)育的進行在不同區(qū)域表達(dá)的模式，提示我們AmphiTCTP是文昌魚脊索和體節(jié)形成相關(guān)的基因。Northernblotting和RT-PCR分析進一步驗證了原位雜交的結(jié)果。Northemblotting采用12h和18h發(fā)育時期的胚胎，雜交結(jié)果均呈一條雜交帶。RT-PCR采用1h,4h，9h,16h發(fā)育

10、時期的胚胎。均有一條PCR產(chǎn)物帶，但在4h發(fā)育期的PCR產(chǎn)物很少。Northernblotting和RT-PCR的實驗結(jié)果與原位雜交結(jié)果是一致的。我們的實驗證實在受精卵內(nèi)存在大量的AmphiTCTPmRNA，說明AmphiTCTP是一個母源性基因。受精四小時的胚胎整裝原位雜交實驗結(jié)果和RT-PCR結(jié)果略有差異，說明這一時期的胚胎AmphiTCTPmRNA含量已經(jīng)很少，母源性產(chǎn)物己消耗殆盡，而胚胎自身尚未表達(dá)或即將表達(dá)，因此原位雜交實驗已

11、檢測不到AmphiTCTP的存在，但RTPCR尚能檢測到微量的AmphiTCTP存在。 G10蛋白是最早發(fā)現(xiàn)于爪蟾卵母細(xì)胞質(zhì)中的一種母源性物質(zhì)，是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在卵母細(xì)胞質(zhì)中存在的母源性G10mRNA，在卵子減數(shù)分裂完成時或受精后的特定時期表達(dá)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)爪蟾G10基因的同源物廣泛地存在于各種生物。我們隨機篩選的文昌魚TCTP同源基因cDNA序列全長693bp，開放閱讀框為62-496bp，尾隨序列為497-603bp.尾隨序列

12、中含有poly(A)尾部，AATAAA的加尾信號以及TATA框，顯示典型的脊椎動物的mRNA的特征.演繹蛋白由144aa組成。 G10與人、大鼠、牛、雞、壁虎、爪蟾、斑馬魚、吳郭魚、黑青斑河豚等脊椎動物的G10同源性高達(dá)86-92﹪，與海膽G10同源性為93﹪，與家蠶、果蠅的G10同源性為90-92﹪,與線蟲的G10同源性高達(dá)72﹪，與惡性瘧原蟲和酵母等低等物種的G10同源性分別為57-59﹪外。 氨基酸序列矩陣分析顯示

13、，AmphiG10亦有3個特定的氨基酸序列段，分別是N端1-10位的氨基酸構(gòu)成一個特定的NTS信號(nucleartranslocationsignal，NTS)，14-38位酸性氨基酸交替出現(xiàn)構(gòu)成特定的酸性氨基酸區(qū)(AcidicDomain)，第三個結(jié)構(gòu)域在富含半胱氨酸的C端，101-119位氨基酸序列含有典型的C2-C2鋅指結(jié)構(gòu)域(ZincFinger)。說明G10是一類金屬依賴性核調(diào)節(jié)蛋白。AmphiG10可能是文昌魚卵裂細(xì)胞增殖

14、的核功能調(diào)控因子。對AmphiG10演繹蛋白的系統(tǒng)進化樹分析顯示，盡管G10蛋白在進化上非常保守，隨著動物的進化也發(fā)生相應(yīng)的微弱改變。AmphiG10演繹蛋白與海膽的G10共處于一個分枝，在脊椎動物G10進化的基部與昆蟲類動物平行分開。表明AmphiG10演繹蛋白的進化與文昌魚本身的動物進化地位基本一致。 核糖體是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器。組成真核生物細(xì)胞質(zhì)核糖體的蛋白有82種，其中49種是大亞基蛋白，33種是小亞基蛋白質(zhì)，這些蛋白不

15、僅與rRNA結(jié)合構(gòu)成核糖體的大亞基和小亞基，而且具有多酶復(fù)合體的特征。隨著生物的進化，生物體內(nèi)的基因也在發(fā)生著相應(yīng)的改變，從而產(chǎn)生了物種的多樣性和蛋白、基因的多樣性。因此，細(xì)胞質(zhì)核糖體發(fā)生相應(yīng)的改變就在所難免。系統(tǒng)地進行核糖體蛋白的進化分析，找到適合動物進化研究的核糖體蛋白分子標(biāo)簽(molecularmarker)，從而有可能把分析核糖體蛋白及其編碼基因的序列作為鑒定物種的有效工具，正是本研究開展核糖體蛋白分析的主要目的。 通過

16、規(guī)模化測序，得到64種文昌魚核糖體蛋白cDNA序列，其中60S大亞基的蛋白35種，40S小亞基的蛋白29種。具有完整閱讀框的基因大亞基有18個，分別是L9,L11，L12，L15,L18,L22,L23a,L24,L26,L27,L30,L35,L36,L37a,L38,L39,P1，P2；小亞基也有17個，分別是S4,S6,S7,S10,S12,S13，S15a,S16,S17,S18,S19,S21，S23，S25,S27a,S28

17、,S30.本研究對33種核糖體蛋白開展了基因序列分析、蛋白二級結(jié)構(gòu)分析、蛋白氨基酸序列的同源性分析和蛋白系統(tǒng)進化樹的分析四個方面的研究。 通過系統(tǒng)進化樹分析，我們將文昌魚的核糖體蛋白進化樹分成五種類型，即點輻射型、節(jié)肢動物分枝偏向型、脊椎動物分枝偏向型、過渡型和原始型。根據(jù)各類型的特點將文昌魚核糖體蛋白進行了歸類。由于文昌魚的核糖體基因大多數(shù)具有脊椎動物的結(jié)構(gòu)特點，大多數(shù)核糖體蛋白與脊椎動物的同源蛋白的同源性高于其它物種