常見毛癬菌穩(wěn)定性及核糖體基因分型的研究.pdf

1、毛癬菌屬是皮膚癬菌病最常見的致病菌，其中又以紅色毛癬菌和須癬毛癬菌最為多見。二者不僅能引起體股癬、手足癬、甲癬、頭癬等癬病，還能引起膿癬、膿腫和肉芽腫等深部感染。癬病極為頑固，常出現(xiàn)復(fù)發(fā)和再感染，現(xiàn)有藥物難以達(dá)到根治的效果。本文針對皮膚癬菌菌落的色澤、形態(tài)學(xué)易變異和細(xì)胞生理和生化學(xué)特征，通過對菌株株系及傳代過程的表型鑒定，確定傳代在表型變異中影響，以及這種變異是否具有可逆性。對已變異表型的菌株進(jìn)而從基因水平上進(jìn)行探討，從而比較在保存和傳

2、代過程中該菌表型與基因型的穩(wěn)定性關(guān)系。同時(shí)，本研究還利用分辨率較高的tDNA-RFLP與Southern印記雜交技術(shù)和PCR擴(kuò)增核糖體基因?qū)煞N最常見的毛癬菌即紅色毛癬菌和須癬毛癬菌進(jìn)行基因分型，探討二者基因型與表型、發(fā)病部位和不同地區(qū)來源菌株等臨床特征的相關(guān)性，以備臨床各項(xiàng)研究的需要。 將207株紅色毛癬菌菌株于室溫下保存1年，10株近期獲得的紅色毛癬菌臨床分離株及1株紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，間隔2-4周傳代3-20次后，根據(jù)菌落

3、的形態(tài)和色素特征分別對保存前后、傳代前后的菌株進(jìn)行表型分型。結(jié)果表明保存1年后，其中54株菌株發(fā)生了形態(tài)變異；11株紅色毛癬菌傳代過程中的菌落形態(tài)及色素特征發(fā)生多次變異。因此，證明在保存和傳代過程中，紅色毛癬菌的表型極不穩(wěn)定。 采用RAPD及tDNARFLP-SouthernBlotting的方法對上述10株紅色毛癬菌臨床分離株、1株標(biāo)準(zhǔn)株的原代及傳至3-4代后進(jìn)行基因型的分析，結(jié)果表明原代與傳代后的擴(kuò)增及雜交帶型一致，提示紅色

4、毛癬菌傳代過程中基因型穩(wěn)定。應(yīng)用兩對特異性引物擴(kuò)增其中6株菌株原代及第20代的核糖體保守區(qū)(部分5.8s和ITS-2)、TRS1區(qū)和TRS2區(qū)基因，結(jié)果表明同一菌株的原代與20代PCR指紋圖一致，基因序列基本一致。進(jìn)一步證實(shí)了傳代過程中菌株的核糖體基因是穩(wěn)定的。 對6株紅色毛癬菌原代及其相應(yīng)第20代的核糖體保守區(qū)(部分5.8s和ITS-2)基因序列測定結(jié)果，表明6株紅色毛癬菌原代及其相應(yīng)第20代片段大小均約為320bp，與基因庫

5、紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC28188基因序列比，其同源性達(dá)99％。實(shí)驗(yàn)菌株的TRS-1區(qū)重復(fù)單位基因序列基本相同，但13號菌的TRS-1區(qū)第一個(gè)重復(fù)單位和23號菌第二個(gè)重復(fù)單位的第198-200位堿基TCG由CAT取代，15號菌TRS-1區(qū)第二個(gè)重復(fù)單位中第194位堿基C→G。標(biāo)準(zhǔn)株在TRS-1區(qū)，第20代與原代比，第一個(gè)重復(fù)序列中第39，40位堿基CC→TT，表明傳代后可見個(gè)別堿基的突變。 以真菌通用引物ITS4、NS5擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)

6、株的rDNA部分序列作為探針，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ完全酶切后的49株紅色毛癬菌DNA進(jìn)行印記雜交。根據(jù)帶型將49株紅色毛癬菌分為20種基因型，其中A、B、C三型占臨床分離株的48.98％。大連菌株以A型居多，南京菌株以B、C型居多。提示探針與SouthernBlotting雜交方法是紅色毛癬菌種內(nèi)分型敏感而可靠的方法，基因型與菌種的地區(qū)來源具有相關(guān)性。 應(yīng)用PCR技術(shù)，對6株紅色毛癬菌核糖體保守區(qū)(部分5.8s和ITS-2

7、)、非轉(zhuǎn)錄區(qū)(TRS1區(qū)和TRS2區(qū))基因擴(kuò)增，結(jié)果ITS，TRS-2區(qū)的PCR指紋圖無差異，而TRS-1區(qū)的PCR指紋圖差異明顯，根據(jù)帶型的不同分為3型：type1型(分子量為1.0Kb)占50.0％；type2型(分子量為0.4Kb)占33.3％；type3型(分子量為1.3Kb)占16.7％。以真菌通用引物ITS4、NS5擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)株的rDNA部分序列作為探針，ECL標(biāo)記探針，與EcoRⅠ酶切的基因組DNA進(jìn)行雜交，根據(jù)帶型將35株

8、須癬毛癬菌菌株分為14型，A-D型占62.86％。南方株以A、C型為主，北方株以B、D型為主。提示應(yīng)用探針與SouthernBlotting雜交方法對須癬毛癬菌進(jìn)行種內(nèi)分型敏感性強(qiáng)、分辨力較高；南北方須癬毛癬菌DNA分型存在一定差異。結(jié)論如下： 1.本研究對紅色毛癬菌在保存和傳代的過程中的表型和基因型的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討，結(jié)果表明紅色毛癬菌表型不穩(wěn)定，極易受到外界因素的影響，在傳代和保藏的過程中其菌落形態(tài)、色素極易發(fā)生變異。菌株變

9、異率與傳代次數(shù)呈正相關(guān)，第1代傳至第20代變異率由33.3％增至100％。表明傳代是表型發(fā)生變異的一個(gè)不容忽視的因素。 2.本研究利用PCR法將標(biāo)準(zhǔn)株及繼續(xù)傳代的5株紅色毛癬菌原代及第20代的核糖體保守區(qū)(5.8S和ITS2)和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)內(nèi)的兩個(gè)重復(fù)亞單位(TRS1，TRS2)擴(kuò)增后原代與傳代后電泳的帶型無變化。AP-PCR法和探針雜交法紅色毛癬菌經(jīng)過4代傳代后的基因帶型均未發(fā)生變化，三種方法均表明紅色毛癬菌基因型較

10、穩(wěn)定。對標(biāo)準(zhǔn)株及繼續(xù)傳代的5株紅色毛癬菌原代及第20代的核糖體保守區(qū)(5.8S和ITS2)和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)內(nèi)的兩個(gè)重復(fù)亞單位(TRS1，TRS2)進(jìn)行基因序列測定，結(jié)果顯示保守區(qū)的基因序列與基因庫紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC28188相比，同源性達(dá)99％，表明傳代后種屬的穩(wěn)定性，核糖體保守區(qū)是種間鑒定的核心部位。標(biāo)準(zhǔn)株傳代后可見個(gè)別堿基的突變。 3.本研究用探針與Southernblotting雜交的方法對紅色毛癬菌和須癬毛

11、癬菌進(jìn)行種內(nèi)分型。其結(jié)果紅色毛癬菌分20型(A-n，A-C型占48.98％。須癬毛癬菌分為14型(A-M型)。應(yīng)用PCR擴(kuò)增法，對紅色毛癬菌核糖體基因進(jìn)行基因分型，6株紅色毛癬菌ITS，TRS-2區(qū)的PCR指紋圖無差異，而TRS-1區(qū)的PCR指紋圖差異明顯，根據(jù)帶型的不同分為3型：type1型占50.0％。表明紅色毛癬菌的多態(tài)現(xiàn)象即rDNA非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)內(nèi)有兩個(gè)串聯(lián)排列的亞重復(fù)元件即TRS-1區(qū)較TRS-2敏感，是種內(nèi)分型的重要