酵母菌中谷胱甘肽的合成及穩(wěn)定性研究.pdf

1、谷胱甘肽（GSH）是生物體內(nèi)一種重要的活性三肽，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品等行業(yè)。利用酵母發(fā)酵合成GSH是工業(yè)化生產(chǎn)GSH的主要途徑，目前有關(guān)提高酵母中GSH的合成研究較多，但對(duì)細(xì)胞內(nèi)外GSH的穩(wěn)定性研究較少，而GSH的穩(wěn)定性卻直接影響細(xì)胞酶催化合成GSH的效率。本論文的主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）在優(yōu)化氨基酸添加策略的研究中，選取了GSH合成必需的三種前體以及與半胱氨酸具有協(xié)同作用的甲硫氨酸作為對(duì)象，研究其不同添加時(shí)間和不

2、同添加濃度對(duì)GSH合成的影響，確定了氨基酸的添加對(duì)GSH含量和細(xì)胞干重影響較大。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，分別在停滯期（2 h）添加10 mM谷氨酸，對(duì)數(shù)期（15 h）添加7 mM甘氨酸以及穩(wěn)定期（24 h）添加10 mM半胱氨酸和8 mM甲硫氨酸時(shí)均能有效提高GSH含量，且對(duì)細(xì)胞干重的影響較小。進(jìn)一步設(shè)計(jì)采用單點(diǎn)、兩點(diǎn)和三點(diǎn)的氨基酸添加策略，結(jié)果顯示在發(fā)酵2 h添加10 mM谷氨酸、15 h添加7 mM甘氨酸、24 h添加10 mM半胱氨酸和

3、8 mM甲硫氨酸時(shí)，GSH含量達(dá)到3.89 mg/g wet cells，比對(duì)照組提高了1.04倍，而細(xì)胞干重僅略小于對(duì)照組。
　?。?）谷胱甘肽合成條件優(yōu)化。以GSH含量為響應(yīng)值，采用單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)GSH合成發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)RSM法確定了GSH合成最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵液pH值4.86，補(bǔ)糖量14.09 g/L，添加L型半胱氨酸13.00 mM，甲硫氨酸8.24 mM，此時(shí)GSH含量預(yù)測(cè)值可

4、達(dá)到4.02 mg/g wet cells。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中GSH含量的實(shí)測(cè)平均值為3.99 mg/g wet cells，非常接近模型預(yù)測(cè)值，相對(duì)誤差為0.75％，比優(yōu)化前GSH含量提高了約108.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與回歸方程的預(yù)測(cè)值相吻合，模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵時(shí)響應(yīng)值的結(jié)果。
　?。?）胞內(nèi)外GSH穩(wěn)定性研究。在酵母發(fā)酵培養(yǎng)24 h時(shí)向發(fā)酵液中添加200 mg/L的純品GSH，考察正常環(huán)境條件下發(fā)酵液中GSH的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)GSH存在

5、不穩(wěn)定現(xiàn)象，且GSH氧化是影響其不穩(wěn)定的重要因素；胞內(nèi)GSH變化不明顯。通過(guò)調(diào)控酵母濕重、pH、溫度和氧環(huán)境因素，對(duì)酵母發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵條件為酵母濕重1~2 g、pH3.5~4.5、溫度≤25℃和厭氧培養(yǎng)，GSH的穩(wěn)定性比對(duì)照組明顯增強(qiáng)。
　?。?）抗氧化劑和金屬離子對(duì)GSH穩(wěn)定性影響?？寡趸瘎〥L-二硫蘇糖醇（DTT）或抗壞血酸（Vc）的添加對(duì)GSH穩(wěn)定性保護(hù)作用顯著，能有效減少GSH的氧化；在合適的pH下，添加