富硒及高谷胱甘肽酵母菌選育的研究.pdf

1、本文對高生物量富硒酵母的菌種選育和培養(yǎng)條件初步優(yōu)化進行了研究;并對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH-I進行了克隆,在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達,有效提高了釀酒酵母的谷胱甘肽(GSH)生成量.從300株工業(yè)生產(chǎn)用酵母中,篩選出對亞硒酸鈉抗性較高的菌株.再從中選出生物量較高的二倍體菌株S.cerevisiae ZY-67和細胞硒含量較高的二倍體菌株Saccharomyces kluyveri ZY-

2、198,對其進行生孢子培養(yǎng)和單倍體分離.用亞硝基胍(NTG)對生物量較高的單倍體ZY-67-18(α)和細胞硒含量較高的單倍體ZY-198-21(α)進行誘變,從突變株中選出生物量較高的ZY-67-18-34(α,leu<'->)和硒含量較高的ZY-198-21-6(α,trp<'->)作為融合親株.通過原生質(zhì)體融合,選育具有雙親的優(yōu)良性狀,且遺傳性狀穩(wěn)定的融合子ZFF-28,其硒總含量分別是原始親株ZY-67和ZY-198的2.8倍和

3、2.0倍.通過單因素實驗和正交試驗設計L<,16>(4<'3>×2<'6>),確定了融合子ZFF-28的優(yōu)化培養(yǎng)條件.在優(yōu)化培養(yǎng)條件下,菌株ZFF-28的生物量可達8.2g/L,硒含量達2050μg/g,硒總含量達到了16810μg/L,是培養(yǎng)條件優(yōu)化前的1.3倍,且細胞硒含量的91﹪為有機硒.以GSH含量相對高的1<'＃>釀酒酵母的DNA為模板,通過PCR擴增出4.2kb的目的基因GSH-I片段.將目的基因片段插入穿梭質(zhì)粒YEp352

4、的多克隆位點,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGF-2.pGF-2轉(zhuǎn)化單倍體釀酒酵母YS58,轉(zhuǎn)化子的GSH含量是受體菌的1.7倍,且轉(zhuǎn)化子的生物量沒有因為質(zhì)粒pGF-2的轉(zhuǎn)入而受到影響.將0.43kb的CUPI啟動子片段,0.9kb的金屬硫蛋白基因MTI片段,GSH-I基因片段,BamHI/SalI雙酶切的YEp352片段,用T<,4>連接酶連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGMF.用重組質(zhì)粒pGMF轉(zhuǎn)化青島啤酒酵母S.cerevisiae YSF-31,以銅抗性(