多耐性酒精酵母菌的選育及特性研究

1、研究報(bào)告中國(guó)釀造嘴第鏟113230總第期多耐性酒精酵母菌的選育及特性研究潘靜，王昌祿’，李風(fēng)娟，王玉榮，陳勉華(天津科學(xué)大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)研究室，天津300457)摘要：以釀酒酵母spcl，Y14，S16為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線(xiàn)誘變和篩選，獲得了3株對(duì)溫度、乙醇濃度、pH耐性有所提高的正向突變株UVs，UV。uVl6；以這些菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行三輪原生質(zhì)體融合，最終獲得了能耐受48。C，19％vol乙醇濃度和耐酸(pH2

2、6)的酵母菌3133。該突變株對(duì)溫度和耐酒精能力分別提高了171％和583％。該菌株在35。c下發(fā)酵72h酒精產(chǎn)量為10158：g／L，比出發(fā)菌株spcl在35。C發(fā)酵液中最高乙醇濃度83829／L提高了211％。關(guān)鍵詞：釀酒酵母；原生質(zhì)體融合；耐高溫；耐酒精；耐酸中圖分類(lèi)號(hào)：TS2611文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)；0254—5071(20111050113—03BreedingandcharacteristicsofSacchromyce

3、scerevisiaeconferredmultitolerancesPANJing，WANGChangh’，LIFengjuan，WANGYurong，CHENMianhua(LaboratoryofFoodBiotechnology，CollegeofFoodEngineeringandBiotechnology，TianjinUniversityofScienceandTechnology，Tianjin300457，China)

4、Abstract：UsingSacchromycescerevisiaestrainsspel，Y14andS16asinitialstrains，3mutantsnamedUVs，UVl4andUVl6試tllimprovedtohraliceontemperature，ethanolandpHwereachievedrespectivelyFurthermore，UVs，UVl4andUVl6wereusedusinitialstr

5、ainsforthreeroundsofpmtoplastfusiontoconstructanewstrainT133，whohadtoleranceon19％volethanolandcouldgrowat48。CorpH26Thethermoandeth—analtoleranceofT133wereimprovedby171％and583％，respectivelyBeingfermentedat350Cfor72h，T133p

6、roduced101589／Lethanol，whichWas211％higherthanthehighestethanolyieldofinitialstrainspcl(83829／L)Keywords：Saccharomyeescerev／s／ae；protoplastfusion；thermotolerance；ethanoltolerance；acidtolerance酒精是一種重要的工業(yè)原料，廣泛用于化工、食品、日用化工和醫(yī)

7、藥衛(wèi)生等領(lǐng)域。釀酒酵母是酒精生產(chǎn)的主要菌株，釀酒酵母的耐高溫、耐乙醇性能的高低直接與生產(chǎn)效益相關(guān)。使用耐性酵母不僅有利于降低水耗、電耗，充分利用現(xiàn)有設(shè)備，縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)率，而且在夏季保證了正常生產(chǎn)心1，降低了發(fā)酵液中酒精對(duì)菌體本身的毒害作用。新菌種選育的方法很多，包括自然篩選、馴化、誘變、基因工程等技術(shù)。但在耐高溫和耐酒精機(jī)理尚不完全明確時(shí)，不能采用基因t程方法，而基因組改組(Genomeshuffling)正是針對(duì)機(jī)理復(fù)雜又不

8、明確的微生物育種的一種理想方法1。Genomeshuffling的重組對(duì)象是整個(gè)基因組，可以同時(shí)在整個(gè)基因組的不同位點(diǎn)重組，不必了解整個(gè)基因組的序列數(shù)據(jù)和代謝網(wǎng)的信息m1。相對(duì)于常規(guī)的育種技術(shù)，它不僅能整合多個(gè)優(yōu)良性狀突變到一個(gè)菌株中，消除有害突變的積累，而且還有可能可以通過(guò)激活一些沉默基因的表達(dá)來(lái)提高菌株的性能M1。本試驗(yàn)基于基因組改組技術(shù)，采用了紫外誘變和三輪原生質(zhì)體融合技術(shù)相結(jié)合的方法選育多耐性高產(chǎn)酒精酵母。1材料與方法11茵株釀

9、酒酵母spcl、Y14、S16為本研究室保藏。12培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中含2％的瓊脂。高滲培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加05mol／L的蔗糖(固體培養(yǎng)基加入2％瓊脂)。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖240s／L，酵母膏289／L，硫酸銨479／L，pH45。以上培養(yǎng)基滅菌條件為01MPa，20min。13試劑及溶液1moVL山梨醇，0Olmol／LTris—HCl(pH74)，35％PEG4000，蝸牛酶，02％B一巰基乙

10、醇。14試驗(yàn)方法141紫外線(xiàn)誘變出發(fā)菌株分別將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的spcl、Y14、S16酵母菌進(jìn)行紫外線(xiàn)照射，使致死率為80％一95％。經(jīng)數(shù)小時(shí)避光培養(yǎng)后，分別涂布到含有一定乙醇濃度的麥芽汁瓊脂平板和YEPD平板上，置于不同溫度培養(yǎng)。為避免培養(yǎng)基中乙醇揮發(fā)，采用封口膜將培養(yǎng)皿封住。在平板上長(zhǎng)出菌落的速度也作為衡量菌株耐受性的初篩標(biāo)志。142原生質(zhì)體融合將各正突變株分別制備原生質(zhì)體后等量混合，在35％PEG4000的促融下對(duì)各正突變株原生質(zhì)體

11、進(jìn)行融合，使其全基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，通過(guò)定向篩選的方法獲得在耐高溫或耐乙醇性狀上有提高的融合株。再以這些融合株為出收稿日期：2011一01—17作者簡(jiǎn)介：潘靜(1985一)，女，碩士研究生研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)；王昌祿‘，教授，通訊作者。萬(wàn)方數(shù)據(jù)研究報(bào)告中國(guó)釀造甕第驢115230總第期由圖1可看出，溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響較大，在30％時(shí)菌株生長(zhǎng)最好，溫度太低或抬高對(duì)不利于菌株的生長(zhǎng)。232最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定將突變株Tr33的種子液以10

12、％的接種量接入到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH值分別為30、35、40、45、50、55及60，300C培養(yǎng)24h，測(cè)0_D鰳，結(jié)果見(jiàn)圖2。蓄圖2pH值對(duì)突變株1一r33生長(zhǎng)的影響Figure2EffectofpHvalueonthegrowthofthemutantstrainTr38由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值為3—5時(shí)，OD值隨pH值的增大而逐漸增大，當(dāng)pH值為5時(shí)OD值達(dá)到最大，當(dāng)pH值5時(shí)，OD值逐漸下降?？梢钥闯觯蛔冎闕T3

13、3的最適生長(zhǎng)pH值為5。233低pH值對(duì)突變株T133生長(zhǎng)的影響按10％接種量將I“133菌株的種子液接入到內(nèi)置杜氏管的發(fā)酵培養(yǎng)基試管中，培養(yǎng)基pH值分別為20、22、24、26、28和30(乳酸調(diào)節(jié)pH值)，30℃培養(yǎng)24h后觀(guān)察產(chǎn)氣情況，結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。表2突變株TT33的耐酸情況Table2AcidtoleranceofthemutantStrain1_r33注：“”表示產(chǎn)氣，“”的多少表示產(chǎn)氣的多少，“”表示氣泡滿(mǎn)管圖3突變株

14、TT33在低pH值的生長(zhǎng)情況Figure3Growthofthemutantstrain硼atlowpHvalue由表2、圖3可知，突變株TT33在pH26的培養(yǎng)基中能較好的生長(zhǎng)，具有一定的發(fā)酵產(chǎn)氣能力，耐酸度達(dá)到i)H2，6。234最適發(fā)酵溫度的測(cè)定將酵母種子液以8％的接種量接人到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于不同溫度(30℃、32％、35％、37℃、40℃)發(fā)酵72h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各溫度時(shí)的CO：失重，結(jié)果見(jiàn)圖4。攀l|Ⅲ|1螻呂圖4溫度對(duì)突變

15、株T1硝發(fā)酵曲線(xiàn)的影響Figure4EffectoftemperatureonthefermentationcurveofthemutantstrainTr38由圖4可以看出，突變株m3在35℃發(fā)酵72h后，CO：失重達(dá)到最大為1229，說(shuō)明突變株T133在此溫度發(fā)酵力最強(qiáng)；溫度再升高時(shí)，發(fā)酵力呈下降趨勢(shì)，當(dāng)溫度升高達(dá)到柏℃時(shí)，cO：失重為1049，比最高值下降了148％。當(dāng)溫度從35℃下降為30％時(shí)，發(fā)酵力也呈下降趨勢(shì)，30℃時(shí)CO：

16、失重為1169，比最高值下降了49％。235最適發(fā)酵pH值的測(cè)定將酵母種子液以8％的接種量接入到不同pH值(25、30、35、40、45、50，55和60)的發(fā)酵液中，35℃發(fā)酵72h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)各pH值的CO：失重，結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5pH值對(duì)突變株TT33發(fā)酵曲線(xiàn)的影響Figure5EffectofpHvalueonthefermentationcurv夠ofthemurantstrainTKl3由圖5可以看出，pH值為45時(shí)，酵母發(fā)