運(yùn)用多核糖體生物芯片技術(shù)對食管鱗狀細(xì)胞癌基因分型的研究.pdf

1、目的:我國是食管癌發(fā)病率最高的國家之一,每年大約有30萬新發(fā)病例,食管癌具有高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),同年齡段、同性別、腫瘤大小相似、病理所見相似、臨床分期相同的患者其生存率長短不一,復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)大相徑庭,提示食管癌可能存在病理不可分的亞型,cDNA microarray(cDNA生物芯片)技術(shù)是把數(shù)千到數(shù)萬個(gè)基因的核苷酸鏈用納米技術(shù)分別打到芯片上,芯片和帶有熒光的cDNA探針雜交,根據(jù)掃描熒光強(qiáng)度測得各個(gè)基因的表達(dá)量,生物芯片技術(shù)已經(jīng)用于

2、食管癌分型,利用它已經(jīng)鑒別出了區(qū)分Barrett食管和食管癌的基因群,也鑒別出了在食管癌及相對應(yīng)的正常組織不同表達(dá)的基因群,日本學(xué)者也證實(shí)了食管鱗狀細(xì)胞癌不同的基因型可以預(yù)測轉(zhuǎn)移率。而對于我國的食管癌尚未有系統(tǒng)的可以預(yù)測術(shù)后生存率及轉(zhuǎn)移情況的芯片基因分型的報(bào)道,多核糖體芯片比普通cDNA芯片更接近于蛋白表達(dá)量變化,本課題運(yùn)用多核糖體基因芯片技術(shù),對食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本進(jìn)行多核糖體eDNA基因分析和分型,并力爭找出在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起決定意

3、義的基因或基因組,指導(dǎo)術(shù)后治療,提高患者生存率。
　　 方法:
　　 1：研究對象:選取2009年1月至2009年3月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科經(jīng)手術(shù)切除及病理學(xué)檢查證實(shí)的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本16例,其中Ⅱ期9例,Ⅲ期7例,患者術(shù)前未經(jīng)過放療和化療,標(biāo)本病理類型由資深主任醫(yī)師確認(rèn)后迅速冷凍在液氮中,置于-80℃的冰箱中保存。多核糖體基因芯片由美國Agilent公司提供,每張芯片有44000個(gè)點(diǎn),含34000個(gè)已知基因。

4、r>　　 2：多聚核糖體RNA提取:取冰凍的食管癌組織200mg在研缽中碾成粉末,將粉末溶解在1ml裂解緩沖液中,同時(shí)加入1％脫氧膽酸溶解蛋白。裂解溶液用移液器吹打后在4℃以12000g離心10秒鐘將細(xì)胞核去除,將離心后的上清液加入500ul提取緩沖液,在4℃以12000g離心5分鐘將線粒體、核膜碎片和其他細(xì)胞器去除,將離心后的上清液放入蔗糖密度梯度(15％-40％),在SW41Ti rotor中于4℃以38000g離心120分鐘,由

5、上到下逐次提取1ml上清液,共收集12管,各管分別加入100ug蛋白酶K于37℃處理30分鐘,用酚氯仿酒精將RNAs萃取重吸收,用酒精沉淀RNA并收集。
　　 3：探針標(biāo)記及microarray試驗(yàn):用逆轉(zhuǎn)錄酶(invitrogen公司)轉(zhuǎn)錄RNA,以Cy3-DUTP(Agilcm公司)標(biāo)記腫瘤RNA,Cy5-DUTP標(biāo)記人正常參照RNA(Human reference RNA),將標(biāo)記好的探針和44k多核糖體基因芯片(Agil

6、ent公司)雜交,用GcnePix4000A scarier(invitrogen公司)掃描芯片圖像,并用GcncPix Pro4.0軟件分析結(jié)果,使用非監(jiān)督分層聚類分析方法自動(dòng)將食管鱗狀細(xì)胞癌基因分型;用微陣列顯著性分析方法鑒定出兩型間顯著變化的基因。
　　 結(jié)果:
　　 1：紫外分析及電泳檢測顯示成功提取了高質(zhì)量的polysomeRNA;并獲得食管鱗狀細(xì)胞癌多核糖體生物芯片表達(dá)圖譜,圖像位點(diǎn)及密度均勻,圖像清晰。

7、r>　　 2：使用非監(jiān)督分層聚類分析方法對16例食管鱗狀細(xì)胞癌多核糖體基因表達(dá)譜進(jìn)行分析,將每例標(biāo)本表達(dá)的基因作為一類,計(jì)算16例標(biāo)本表達(dá)基因兩兩之間的距離,構(gòu)成距離矩陣,合并距離最近的兩類為一新類,根據(jù)基因表達(dá)相似性分為A、B兩亞型,A亞型有4例,B亞型有12例。
　　 3：以微陣列顯著性分析方法在P=0.01水平鑒定出A亞型和B亞型間顯著變化的基因,共找出832個(gè)差異表達(dá)基因,這832個(gè)基因涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號