HCV基因分型生物芯片的研制及HCV基因型與自身免疫關系的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是血源性肝炎的主要病因，感染后極易慢性化，并與肝硬化和原發(fā)性肝癌的發(fā)生關系密切，對人類健康危害很大。HCV感染是我國目前一個嚴重的衛(wèi)生問題。HCV是單股正鏈線狀RNA病毒，由于缺乏復制酶校準功能及易誤性RNA依賴性RNA多聚酶的存在，其基因組的主要特點為多態(tài)性和高度變異性。目前，世界范圍內(nèi)已經(jīng)克隆到的分離株可分為11個基因型(gerlotype)，其中又可以分為約90個亞型(su

2、btype)。HCV分型研究對HCV流行病學、進化機制，診斷、療效預測、預后判斷等方面都有重要意義。HCV感染可引起機體免疫功能紊亂進而引發(fā)機體自身免疫?；诜肿幽M的理論，HCV感染導致自身免疫疾病中所出現(xiàn)的自身抗體的種類和數(shù)量，丙型肝炎的發(fā)生發(fā)展過程、預后、治療都有可能直接與所感染的HCV的型別有關。生物芯片技術(shù)由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以對樣品中的不同核酸序列進行檢測和分析。商品化高精度自動化微陣列點樣儀的出現(xiàn)，使得

3、規(guī)范化制作用于疾病診斷的芯片成為現(xiàn)實，借助具有卓越性能的激光共聚焦顯微掃拙技術(shù)可對雜交信號進行實時、靈敏、準確的檢測和分析。 本文選擇先設計型特異性寡核苷酸探針，在玻璃基底上點樣固定，再與丙肝病人血清經(jīng)過熒光標記逆轉(zhuǎn)錄套式-PCR后得到的HCV 5'UTR區(qū)cDNA片段雜交，用激光共聚焦掃描儀讀出雜交后的熒光信號，陣列模式(pattern)經(jīng)計算機識別給出分型的方法，進行芯片上的HCV基因分型。在初步獲得分型結(jié)果后，同時檢測不同

4、基因型HCV感染患者血清中的自身抗體譜，試圖探討丙型肝炎病毒基因型與自身免疫關系，為臨床治療提供有價值的資料。 1.HCV基因分型生物芯片的設計。通過對國際公共生物信息數(shù)據(jù)庫Genbank的檢索和查找，以及生物信息處理軟件的綜合應用，總結(jié)出了一套病毒基因分型的探針設計方法和過程。在認識HCV基因組的高度變異性，基因組各組成的結(jié)構(gòu)和功能，了解HCV分型方法現(xiàn)狀的基礎上提出了用5'UTR和C區(qū)聯(lián)合型特異性探針雜交生物芯片基因分型的方

5、法。在對世界各地克隆到的約125個有代表性的HCV分離株5'UTR核酸序列，以及約80個C區(qū)核酸序列做出分析后，根據(jù)生物芯片的探針設計原則，設計出一套共36顆HCV型特異性探針。芯片上的探針陣列雜交信號構(gòu)成了約33種模式(Pattern)，這些Pattern共約代表了25個HCV基因型和基因亞型。利用計算機的對Pattern的識別可以實現(xiàn)用生物芯片快速準確地進行大規(guī)模HCV基因分型診斷。 2.HCV基因分型生物芯片的制作。通過分

6、子自組裝和共價偶聯(lián)技術(shù)，成功制備了兩種可與寡核苷酸探針以共價鍵連接的生物芯片玻璃載體：APTES-GA修飾玻片和APTES-PDC修飾玻片。以AES和AFM加以表征，證明修飾成功。在激光共聚焦掃描儀ScanArray<'TM>Lite下檢測，發(fā)現(xiàn)APTES-PDC修飾的玻片在Cy5熒光染料的激發(fā)光波長范圍內(nèi)具有更好的光學特性，熒光本底更低。用全自動點樣儀Cartesian PixSys<'TM> PA5500構(gòu)建了生物芯片探針陣列。獲得

7、了理想的探針固定密度約1分子/500nm<'2>。 3.HCV基因分型生物芯片檢測的建立和應用。首次采用熒光逆轉(zhuǎn)錄套式PCR的方法，建立了HCV芯片探針雜交的靶序列-HCV5’ UTR cDNA的穩(wěn)定擴增過程，并標記上Cy5熒光分子。找到了成功擴增同時用熒光染料均一標記靶序列的較佳的Cy5熒光標記物的摻入比。通過多次試驗，綜合比較影響雜交的各種條件，建立了簡單但效果良好的芯片雜交體系和過程。初步建立了所制備的HCV基因分型芯片

8、在ScanArray<'TM> Lite激光共聚焦掃描儀下從檢測開始到出臨床檢測報告單的電子化過程。對21例南京市第二醫(yī)院初診HC住院患者的血清樣品進行檢測，獲得了良好的雜交信號和初步的分型診斷結(jié)果。 4.HCV基因型與自身免疫的關系。文中對21例南京市第二醫(yī)院初診HC住院患者的血清樣品進行了自身抗體譜的測定，每份樣品共檢測了9種自身抗體，包括抗核抗體(ANA)、RE、ads-DNA、抗Sm、抗SSA、抗Jo-1、抗心磷脂抗體(