HCV全基因組復(fù)制子的構(gòu)建及HCV6型患者PEG-IFN療效分析.pdf

1、本文分兩個(gè)部分進(jìn)行探討。
　　第一部分 構(gòu)建雙核酶自切割HCV JFH1復(fù)制子并研究其體內(nèi)外復(fù)制特性
　　目的：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)基因組長(zhǎng)度為9.6kbp，是正鏈RNA病毒，其基因組由編碼區(qū)、非編碼區(qū)兩部分構(gòu)成。編碼區(qū)包含:核心蛋白區(qū)、包膜蛋白區(qū)、P7蛋白區(qū)、非結(jié)構(gòu)區(qū);非編碼區(qū)是由5'與3'非編碼區(qū)組成。HCV是導(dǎo)致慢性丙型肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原體，目前已有越來(lái)越多的人受到該病毒

2、的困擾，但迄今為止依然沒(méi)有對(duì)應(yīng)有效的疫苗。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，目前全世界范圍內(nèi)共有1.8億慢性丙型肝炎患者，HCV防治已經(jīng)成為我國(guó)乃至全球的最主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　本研究基于JFH1 cDNA序列，建立了雙核酶自切割HCV全基因組復(fù)制子，該復(fù)制子可在細(xì)胞內(nèi)直接啟動(dòng)HCV復(fù)制，并包裝出具有感染性的病毒顆粒，病毒進(jìn)行復(fù)制、包裝、釋放、重新感染的過(guò)程，保持了培養(yǎng)系統(tǒng)里HCV長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定和高效率的復(fù)制，模擬了HCV完整的生命周期循環(huán)，

3、可用于HCV生物學(xué)特性研究及抗HCV藥物長(zhǎng)期的觀察和篩選。并且該復(fù)制子也可進(jìn)行動(dòng)物模型的研究。
　　方法：1.在HCV JFH1及HCV JFH1/GND的cDNA序列兩側(cè)分別利用PCR基因重組技術(shù)加上核酶序列，分別與真核表達(dá)載體pcDNA3.1進(jìn)行基因重組，構(gòu)建含雙核酶自切割序列HCV JFH1全基因組復(fù)制子，即重組質(zhì)粒pcDNA3.1-RZ-JFH1和其陰性突變株pcDNA3.1-RZ-JFH1/GND。
　　2.我們把

4、構(gòu)建的復(fù)制子化學(xué)轉(zhuǎn)染進(jìn)Huh7.5細(xì)胞、通過(guò)尾靜脈高壓注射進(jìn)行昆明小鼠的實(shí)驗(yàn)。觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清HCV RNA、小鼠血清HCV RNA水平;細(xì)胞免疫熒光、免疫組化學(xué)染色和相關(guān)的血清學(xué)檢查分別測(cè)試該復(fù)制子的體內(nèi)和體外復(fù)制的特點(diǎn)。
　　結(jié)果：1.雙核酶自切割HCV JFH1全基因組復(fù)制子構(gòu)建成功:重組質(zhì)粒pcDNA3.1-RZ-JFH1及pcDNA3.1-RZ-JFH1/GND，經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鑒定，酶切條帶大小均與預(yù)期一致，

5、重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2.在16周的檢測(cè)期內(nèi)，從轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RZ-JFH1復(fù)制子的Huh7.5培養(yǎng)液中長(zhǎng)時(shí)間平穩(wěn)的檢測(cè)出HCV RNA，其拷貝數(shù)可達(dá)到1×106～3×106/ml。pcDNA3.1-RZ-JFH1/GND細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HCV RNA水平一直低于檢測(cè)下限。
　　3.復(fù)制子pcDNA3.1-RZ-JFH1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中出現(xiàn)HCV核心抗原染色陽(yáng)性細(xì)胞約占20％; HCV感染組細(xì)胞中出現(xiàn)HCV核心抗原染色

6、陽(yáng)性的細(xì)胞約占5％。復(fù)制系統(tǒng)里包裝出的的病毒顆粒有感染性，可以感染新的Huh7.5細(xì)胞。
　　4.短期的病毒血癥在尾靜脈高壓注射了HCV JFH1復(fù)制子的昆明小鼠中被檢出，隨后進(jìn)行的其肝臟免疫組化染色中，HCV抗原陽(yáng)性細(xì)胞未被觀察到，同時(shí)小鼠血清中也未能檢測(cè)到HCV抗體。
　　結(jié)論：本研究建立的HCV JFH1全長(zhǎng)復(fù)制子可以在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間、平穩(wěn)、高效地包裝出具有感染性的HCV病毒顆粒，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，未能取得理想效果

7、;可能是HCV JFH1病毒株來(lái)源的特殊性導(dǎo)致了這種結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的HCVJFH1全長(zhǎng)基因組復(fù)制子了，在HCV生物學(xué)特性研究和抗HCV藥物測(cè)試等方面可以起到很大的作用。
　　第二部分 聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療HCV6型感染者的臨床療效回顧性分析
　　目的：研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇干擾素(pegylated interferon，PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin，RBV)治療HCV，已經(jīng)成為臨床醫(yī)生的共識(shí)，但

8、是療效上卻取決于HCV感染的基因型，不同的基因型所取得的持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答(sustainedvirological response，SVR)率有明顯差異，有研究提示HCV1型最低，只有40-50％左右，HCV2/3型可達(dá)到70-80％，甚至可以更高。HCV共有6個(gè)基因型，其中1型、2型和3型呈全世界分布，而4型、5型主要分布在非洲，6型主要流行于亞洲。由于世界經(jīng)濟(jì)及醫(yī)療衛(wèi)生的格局，HCV4型、5型、6型的研究甚少，主要的研究集中在HC

9、V1型、2/3型。
　　近年來(lái)，我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，HCV的傳播方式發(fā)生了改變，輸血和使用血液制品導(dǎo)致的HCV感染已經(jīng)明顯下降，隨之而來(lái)的是靜脈吸毒導(dǎo)致的HCV感染比例明顯提高。由于靜脈吸毒史是導(dǎo)致HCV6型感染的主要原因，所以我們國(guó)家的HCV6型感染者比例呈上升趨勢(shì)，有研究表明，這種趨勢(shì)尤其以我國(guó)西南地區(qū)為甚，這可能與我國(guó)西南地區(qū)毗鄰東南亞全球毒品主要生產(chǎn)地之一的緣故。HCV6型感染者的比例不斷升高，對(duì)我們的臨床治療提出了規(guī)

10、范化要求。目前HCV1型和2/3型感染者臨床上均有標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，但HCV6型感染者的治療方式及療程還需進(jìn)一步探討、商榷并確定。曾經(jīng)有報(bào)道分析HCV1型、2/3型、6型病例的PEG-IFN聯(lián)合RBV抗病毒治療效果，研究發(fā)現(xiàn)，HCV1型治療效果最差，而HCV6型病例治療效果明顯好于HCV1型，但是和HCV2/3型病例的抗病毒療效無(wú)明顯差異。另外有研究將HCV6型分別應(yīng)用了24w和48w的PEG-IFN聯(lián)合RBV的病例入組，比較兩者在治療時(shí)

11、間上抗病毒效果的差異，最后發(fā)現(xiàn)兩者的療效沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。由于目前有大量的報(bào)道都認(rèn)為HCV6型病例應(yīng)用PEG-IFN聯(lián)合RBV治療24w取得的效果可以達(dá)到HCV2/3型同樣治療方案的水平。
　　本研究在重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染科的所有門診和住院的病人中，收集了2010年5月-2014年10月應(yīng)用PEG-IFN聯(lián)合RBV治療的HCV6型、2/3型感染者的詳細(xì)病例資料進(jìn)行回顧性分析，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的入組篩選過(guò)程，我們最終入組了137例病

12、人。HCV6型患者53例，HCV2/3型患者84例。通過(guò)比較基線資料，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒應(yīng)答情況來(lái)比較兩組間療效的差別，用來(lái)對(duì)臨床工作作出指導(dǎo)。
　　方法：收集重慶西南醫(yī)院感染病專科醫(yī)院2010年5月至2014年10月所有門診和住院期間應(yīng)用PEG-IFN聯(lián)合RBV治療的HCV6型感染者和2/3型感染者的臨床資料（年齡、性別、HCV RNA水平、ALT水平、腹部彩超結(jié)果、感染途徑、治療過(guò)程），進(jìn)行病例入組，所有納入病例符合以下納入條件

13、:(1)利巴韋林每日用量針對(duì)體重＜65kg、65-85kg、＞85kg的病人分別為800mg、1000mg、1200mg;派羅欣皮下注射180μg/周;佩樂(lè)能每周皮下注射1.5μg/kg;(2)治療時(shí)間大于等于24周，小于等于26周。并且有6個(gè)月以上隨訪完整資料;(3)排除HBV、HIV、糖尿病、高血壓、自身免疫性肝病等疾病。將患者分為HCV6型與2/3型感染者兩組，分別對(duì)兩組患者的RVR、EVR、SVR進(jìn)行比較。采用SPSS18.0軟

14、件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的方式標(biāo)出。t檢驗(yàn)被應(yīng)用到對(duì)基線計(jì)量資料的比較中;率的比較采用x2檢驗(yàn);對(duì)感染者基線資料與最終抗病毒療效的影響，采用多因素Logistic回歸分析;對(duì)療效評(píng)價(jià)采用非劣效檢驗(yàn)，即當(dāng)試驗(yàn)組非劣于對(duì)照組時(shí)，認(rèn)為試驗(yàn)成功。經(jīng)臨床專家商討，非劣效性界值△=15％，P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.HCV6型與2/3型感染者年齡及性別分布、治療前血清HCV RNA與ALT水平以及應(yīng)用

15、PEG-IFN種類均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但吸毒史在HCV6型感染者中的比例高于HCV2/3型感染者所占的比例(P=0.001)。
　　2.HCV6型、2/3型感染者獲得RVR比例分別是88.7％、89.3％，率差95％可信區(qū)間為:（-0.1139，0.1019）;獲得EVR的比例分別是94.3％、96.4％，率差95％可信區(qū)間為:（-0.0950，0.0530）;獲得SVR的比例分別是86.8％、90.5％，率差95％可信區(qū)間為:（-0

16、.1476，0.0736）;HCV6型、2/3型感染者RVR對(duì)SVR的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為89.4％、93.3％，率差95％可信區(qū)間為:(-0.1436，0.0656);EVR對(duì)SVR的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為88.0％、91.4％，率差95％可信區(qū)間為:(-0.1428，0.0748)。上述指標(biāo)的率差95％可信區(qū)間下限均小于非劣效性界值0.15，非劣效性檢驗(yàn)成立，可以認(rèn)為在上述各項(xiàng)指標(biāo)的比較中，HCV6型感染者非劣于HCV2/3型感染者。