HCV復(fù)制子用于抗丙肝中藥的篩選及組方.pdf

1、丙型肝炎是全世界流行的傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization，WHO)報(bào)道，全球流行率約3％。我國流行率為3.2％，感染者約為4000萬。丙型肝炎易于慢性化，病情隱匿性進(jìn)展，至出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，常已出現(xiàn)了肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。丙型肝炎的治療目的是清除病毒，目前干擾素聯(lián)合利巴韋林是抗丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)治療的最佳方案，但其治愈率僅約50％，且副作用大，臨床上約50-6

2、0％的丙型肝炎患者無法從中獲益。新近上市和目前正在研究的多種蛋白酶抑制劑均需與干擾素聯(lián)用，單獨(dú)應(yīng)用短期內(nèi)即出現(xiàn)耐藥，因而臨床迫切需要探索新的治療手段。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)一些中藥具有抗病毒作用，但針對抗HCV中藥篩選的報(bào)道極少，且前期研究多采用裸鼠接種實(shí)驗(yàn)，成本高，工作強(qiáng)度大，難以做到高通量篩選。本研究采用同時(shí)表達(dá)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和海腎熒光素酶的HCV復(fù)制子細(xì)胞系sH7(H7-HCV-L7)為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，利用血漿藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，篩選抗HCV中藥

3、。由于動物血漿超過一定濃度會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，所以我們在第一部分首先探討了在細(xì)胞培養(yǎng)條件下動物血漿對細(xì)胞的影響，確定了最適血漿來源動物種屬及血漿的最佳作用時(shí)間和添加濃度；在此基礎(chǔ)上，第二部分對16種可能有較高抗HCV作用的中藥進(jìn)行篩選，組方并驗(yàn)證。
　　第一部分、細(xì)胞培養(yǎng)條件下動物血漿對細(xì)胞的影響
　　目的：將H7-HCV-L7細(xì)胞接種于裸鼠皮下，制備裸鼠體內(nèi)適應(yīng)性細(xì)胞系mH7-HCV-L7，使其能承受較高濃度的小鼠血漿；

4、選取適宜的動物血漿，確定血漿的最佳作用時(shí)間和添加濃度。
　　方法：
　　1.制備裸鼠體內(nèi)適應(yīng)性細(xì)胞系mH7-HCV-L7并驗(yàn)證：將腫瘤細(xì)胞H7-HCV-L7接種于裸鼠皮下，形成腫瘤后荷瘤繼續(xù)飼養(yǎng)2月；無菌條件下取瘤體，制備裸鼠體內(nèi)適應(yīng)性細(xì)胞系mH7-HCV-L7并培養(yǎng)；應(yīng)用CCK-8法對不同濃度(10％、20％、30％、40％)小鼠血漿作用于H7-HCV-L7及mH7-HCV-L7細(xì)胞24h、48h、72h的細(xì)胞毒性進(jìn)行比較

5、；
　　2.清潔級KM小鼠、Wistar大鼠、新西蘭兔血漿，分別以不同濃度(10％、20％、30％、40％)作用于H7-HCV-L7細(xì)胞不同時(shí)間(24h、48h、72h)后，應(yīng)用CCK-8法對其細(xì)胞毒性進(jìn)行分析，確定最適血漿來源動物種屬及血漿的最佳作用時(shí)間和添加濃度。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠血漿作用于H7-HCV-L7及mH7-HCV-L7細(xì)胞的細(xì)胞毒性比較：
　　1.1 隨著所添加小鼠血漿濃度的升高，作用時(shí)間

6、的延長，H7-HCV-L7及mH7-HCV-L7細(xì)胞組的光密度(Optical Density，OD)值均降低，所表現(xiàn)的毒性均增加；
　　1.2 10％的小鼠血漿作用于mH7-HCV-L7細(xì)胞24h及48h后的OD值略高于相應(yīng)的作用于H7-HCV-L7細(xì)胞，其他濃度及時(shí)間點(diǎn)則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　1.3 10％的小鼠血漿對mH7-HCV-L7細(xì)胞仍有較高的毒性。(24h、48h、72h細(xì)胞存活率分別為75.30％、57.2

7、9％、21.12％)
　　2.小鼠、大鼠、兔血漿作用于H7-HCV-L7細(xì)胞的細(xì)胞毒性比較：
　　2.1 相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相同濃度的動物血漿比較，均以小鼠血漿的OD值最低，兔血漿的最高，大鼠血漿的居中；
　　2.2 相應(yīng)各組48h的OD值與24h的OD值比較，P>0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異；相應(yīng)各組72h的與24h的比較，30％、40％兔血漿組、DMEM對照組，P<0.05，差異有顯著性；
　　2.3 10％、20％、

8、30％兔血漿組與DMEM對照組48h的OD值比較，P>0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異，既有血漿本身對細(xì)胞的毒性作用，又有其作為營養(yǎng)物質(zhì)對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用；40％兔血漿組與DMEM對照組48h的OD值比較，P<0.05，則主要表現(xiàn)為抑制H7-HCV-L7細(xì)胞生長的作用。
　　結(jié)論：
　　1.裸鼠體內(nèi)適應(yīng)性細(xì)胞系mH7-HCV-L7仍然難以容忍較低濃度的小鼠血漿；
　　2.以兔血漿最適合H7-HCV-L7的生長，最佳作用時(shí)間

9、為48h，考慮血漿中藥物成分本身可能對細(xì)胞生長產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用，故為留有余地，確定后續(xù)篩選抗HCV中藥時(shí)兔血漿的添加濃度為20％。
　　第二部分、應(yīng)用血漿藥理學(xué)方法及HCV復(fù)制子篩選抗丙肝中藥及組方
　　目的：篩選出對HCV抑制率較高的中藥，組方并驗(yàn)證。
　　方法：
　　1.應(yīng)用含有HCV復(fù)制子的H7-HCV-L7細(xì)胞系及中藥血漿藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，對16種可能有較高抗HCV作用的中藥(黑蕊虎耳草、大血藤、五爪金龍

10、、白雪花、云南美登木、梔子、滇丹參、苦參、雞爪大黃、山豆根、苦味葉下珠、紅腺忍冬、龍膽草、黃芩、肉桂、女貞子)進(jìn)行篩選：
　　1.1 制備含藥兔血漿及空白兔血漿；
　　1.2 應(yīng)用CCK-8法及48孔板做H7-HCV-L7的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
　　1.3 接種細(xì)胞于48孔板中，貼壁培養(yǎng)24小時(shí)；換液加20％含藥兔血漿及20％空白兔血漿，持續(xù)作用48小時(shí)；
　　1.4 應(yīng)用CCK-8法測定各孔光密度(Optical Den

11、sity，OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率及各孔細(xì)胞數(shù)；
　　1.5 應(yīng)用海腎熒光素酶發(fā)光試劑盒及Glomax20/20發(fā)光檢測儀測定各孔熒光值，計(jì)算各孔單個細(xì)胞熒光值；
　　1.6 計(jì)算各中藥抗HCV抑制率，從高到低進(jìn)行排名比較。
　　2.選取抑制率較高的中藥組方并驗(yàn)證
　　2.1 根據(jù)細(xì)胞毒性、抑制率排名、各中藥性味功效及臨床常用治療肝病中藥方劑，選取中藥組方如下：
　　方一：大血藤12g、五爪金龍8g、云南美

12、登木45g、黃芩6g；方二：女貞子10g、五味子5g、黃芪20g、黨參10g；方三：大血藤12g、五爪金龍8g、云南美登木45g、黃芩6g、女貞子10g、五味子5g、黃芪20g、黨參10g
　　2.2 測定各中藥組方抗HCV抑制率并進(jìn)行排名比較：同方法1。
　　3.進(jìn)一步驗(yàn)證抑制率較高的中藥及中藥組方：
　　3.1 用Promaga公司的SV Total Isolation System，提取中藥組方及方一中各中藥血漿

13、作用于H7-HCV-L748小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)；
　　3.2 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Ploymerase chain reaction，PCR)檢測各組樣品HCV RNA拷貝數(shù)(copies/mL)；
　　3.3 用核酸蛋白分析儀定量各樣品中的總RNA濃度(μg/mL)，計(jì)算平均每微克總RNA所含HCV RNA拷貝數(shù)；計(jì)算抑制率，進(jìn)行排名比較；
　　結(jié)果：
　　1.

14、利用單個細(xì)胞熒光值所計(jì)算的抑制率中，20％含大血藤、五爪金龍、云南美登木、黃芩的兔血漿抑制率較高，分別為51.73％、43.46％、32.62％、23.68％，且無明顯細(xì)胞毒性；中藥組方中方三對HCV抑制率最高，方二最低，方一略低于方三。
　　2.利用每微克總RNA中HCV RNA拷貝數(shù)所計(jì)算的抑制率中，以單味中藥抑制率高，排名仍為大血藤、五爪金龍、云南美登木、黃芩，而組方抑制率較低；組方間抑制率從高到低排名仍為方三、方一、方二。