丙烯酰胺修飾核酸凝膠固定芯片制備及在SNP、甲基化檢測中的應(yīng)用.pdf

1、基因芯片即將DNA探針固定于固相支持物表面，從而產(chǎn)生DNA探針陣列，然后與樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對生物樣品的檢測及分析?；蛐酒夹g(shù)是高效地大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的主要手段，其在基因表達(dá)差異分析方面的巨大優(yōu)勢必將在后基因組時(shí)代發(fā)揮極其重要的作用?；蛐酒脑O(shè)計(jì)與制備直接關(guān)系到檢測的通量與結(jié)果的分析，是整個(gè)技術(shù)流程中最為關(guān)鍵的一步。其制備方法主要分為原位合成法與點(diǎn)樣法，后者各個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)均較成熟且靈活性大，可用于制備中低密度的

2、基因芯片，其原理是通過物理或化學(xué)的方法將DNA片段固定與固相支持物表面以獲得探針陣列。在固相支持物的選擇上，表面經(jīng)過化學(xué)修飾的玻片與其他基底材料相比具有巨大優(yōu)勢而被廣泛使用。在玻片表面修飾技術(shù)上，通過特異的化學(xué)修飾使其表面形成不同生物特異性的親和基底，并通過相應(yīng)的化學(xué)機(jī)理來連接、固定DNA片段。二維基因芯片暴露出固定DNA量少、檢測靈敏度低、成本高等諸多缺點(diǎn)，而可以解決上述問題的三維親水多孔凝膠芯片又因背景噪音、制備比較復(fù)雜而不能廣泛應(yīng)

3、用。聚丙烯酰胺凝膠芯片因具有簡單的化學(xué)機(jī)理、高探針密度與相對高的熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)而被不斷發(fā)展，但仍不能很好解決背景噪音問題，且傳統(tǒng)制備過程不能保證樣品的均勻一致。因此，本文圍繞新的制備方法及對背景噪音的處理展開討論，優(yōu)化制備條件及電泳條件，并將其應(yīng)用與SNP與DNA甲基化的檢測中。具體內(nèi)容如下： 1．聚丙烯酰胺凝膠芯片制備及在 SNP 分型中的應(yīng)用我們首先提出新的丙烯酰胺修飾核酸的固定方法——將丙烯酰胺基團(tuán)修飾的 DNA、丙烯酰胺

4、單體、過硫酸銨按比例混合后點(diǎn)樣于玻片表面，在真空環(huán)境下利用四甲基乙二胺的揮發(fā)并接觸陣點(diǎn)，從而促使預(yù)聚合物形成聚丙烯酰胺凝膠。利用普通電泳槽電泳代替?zhèn)鹘y(tǒng)的洗滌來清除非特異性鍵合的探針，并優(yōu)化了電泳電壓、時(shí)間、溫度以獲得最佳熒光信號(hào)。進(jìn)一步研究了DNA濃度對結(jié)果的影響，單堿基錯(cuò)配的識(shí)別，PCR 產(chǎn)物不同變性條件及不同純化處理對結(jié)果的影響。最終將其應(yīng)用到冠心病相關(guān)基因OLR-1的C14417G位點(diǎn)的識(shí)別。 2．聚丙烯酰胺凝膠芯片與Li

5、nker-PCR結(jié)合檢測。DNA 甲基化在p16基因甲基化檢測中，電化學(xué)方法雖具有極高的靈敏度，但電極修飾探針過程耗時(shí)且操作麻煩，每次只能檢測一個(gè)樣本的一個(gè)甲基化位點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)高通量檢測，且檢測特異性較差。二維芯片缺點(diǎn)在于信號(hào)極弱，甚至無法檢測出，此外還得純化PCR產(chǎn)物來提高DNA的連接效率與穩(wěn)定性。利用聚丙烯酰胺凝膠芯片的優(yōu)勢可解決上述問題。將一定濃度不同樣本加以固定后，用普通熒光探針雜交便可檢測，滿足高通量、廉價(jià)與便捷。 3

6、．在片反轉(zhuǎn)檢測DNA甲基化我們首次提出該設(shè)想即：將DNA酶切后，在酶切端口連接上丙烯酰胺基團(tuán)修飾的Linker，從而將DNA片段全部固定于玻片上，并采用傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽修飾，以暴露所有的甲基化位點(diǎn)信息。先采用pUC19質(zhì)粒DNA為實(shí)驗(yàn)材料，人為設(shè)計(jì)兩個(gè)相鄰甲基化位點(diǎn)及三組探針(完全匹配、一個(gè)錯(cuò)配、完全錯(cuò)配)，優(yōu)化了預(yù)聚合物體系，亞硫酸氫鹽修飾條件、電泳條件，考察了在片反轉(zhuǎn)對甲基化位點(diǎn)檢測的靈敏度及可信度。以便固定大量不同人基因組DNA，