誘導型一氧化氮合成酶在糖尿病大鼠晶狀體上皮細胞凋亡中表達的研究.pdf

1、目的：一氧化氮(NO)是組織內(nèi)常見的氧化自由基，高度活躍。少量NO可以維持機體正常的生理需求。而大量的NO會對組織細胞造成氧化損傷。一氧化氮合成酶(NOS)是體內(nèi)主要的NO合成限速酶，分為Ⅲ型：Ⅰ和Ⅲ型受細胞內(nèi)Ca<'2+>的調(diào)節(jié)，催化生成少量NO，維持機體需要。Ⅱ型又稱誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)，在一定的刺激下，才被激活，催化生成NO。本實驗應用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導糖尿病大鼠模型，觀察iNOS在糖尿

2、病大鼠晶狀體上皮細胞中的表達情況，以及iNOS的表達與細胞凋亡酶一半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)之間的關(guān)系。并用胰島素(INS)進行干預治療，旨在探討iNOS在糖尿病性白內(nèi)障病變過程中的作用，并為臨床用藥提供理論及實驗依據(jù)。 方法：選擇體重在200±10g，健康無熱源并無眼疾的雄性sprague-Dawlve(SD) 大鼠40只，并隨機分為6只正常組大鼠和34只糖尿病模型組大鼠。適應性喂養(yǎng)3天，34只糖尿病模型組大鼠禁食

3、，自由飲水24小時后，采用腹腔內(nèi)注射sTZ(55mg/kg)誘導糖尿病大鼠模型，3天后采尾靜脈血，確認血糖≥16mmol/L，多飲、多食、多尿為造模成功。34只隨機分為糖尿病組10只；治療組10只；對照組10只。(其中2只血糖未達到標準，2只由于血糖過高，死于并發(fā)癥，未加入實驗)。糖尿病組大鼠和正常組大鼠正常喂養(yǎng)；治療組大鼠每天皮下注射INS(10單位/kg)；對照組大鼠每天皮下注射PBS緩沖液(1ml/kg)。整個實驗過程中用裂隙燈顯

4、微鏡觀察大鼠晶狀體的形態(tài)學變化。分別在造模成功后的第4周、8周，分別處死每組的5只動物(正常組3只動物)。取一側(cè)晶狀體做電鏡切片觀察晶狀體上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。取另一側(cè)晶體固定后，做病理切片及用免疫組化的方法測定各組晶狀體上皮細胞中不同時段iNOS、3-硝基酪氨酸(3-NT)、Caspase-3在蛋白水平的表達。用Image-pro Plus軟件對免疫組化顯色結(jié)果進行拍照、灰度分析。應用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析和配對t

5、檢驗的方法，做統(tǒng)計學的分析。視P<0.05，有統(tǒng)計學意義。結(jié)果： 1．光鏡：正常組大鼠晶狀體上皮細胞形態(tài)未見明顯的變化。糖尿病組大鼠晶狀體上皮細胞出現(xiàn)明顯的細胞排列紊亂，胞核邊集等細胞凋亡的表現(xiàn)。治療組的變化較糖尿病組明顯減輕。對照組的變化同糖尿病組。 2．電鏡：正常組大鼠的晶狀體上皮細胞的細胞核、細胞器(線粒體)及細胞間連接未見明顯的變化。糖尿病組大鼠晶狀體上皮細胞的細胞核出現(xiàn)核固縮、線粒體腫脹，細胞間連接疏松，明顯細

6、胞凋亡的表現(xiàn)。治療組的變化較糖尿病組明顯減輕。對照組的變化同糖尿病組。 3．免疫組化： (1)正常組大鼠晶狀體上皮細胞中無iNOS表達。在持續(xù)高血糖的狀態(tài)下，大鼠晶狀體上皮細胞開始出現(xiàn)iNOS的表達。 (2)隨著iNOS表達的增加，細胞中NO的含量增加，NO使細胞中的酪氨酸硝基化，生成3-NT，對細胞產(chǎn)生毒性作用。同時細胞中凋亡核心酶—Caspase-3被激活，表達逐漸增加，引起細胞凋亡的級聯(lián)反應。 (3