可吸收誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)材料用于周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、一、背景
　　 周圍神經(jīng)損傷和缺損的治療是顯微外科的難題之一，神經(jīng)缺損修復(fù)，尤其是長段周圍神經(jīng)缺損的重建仍是當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)面臨的一個(gè)難題，目前尚缺乏有效地治療手段，一直以來自體神經(jīng)移植是修復(fù)周圍神經(jīng)缺損最理想的手術(shù)方法，在臨床上已廣泛應(yīng)用，也是衡量各種神經(jīng)橋接材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但往往會造成供體神經(jīng)支配區(qū)感覺、功能障礙，且自體神經(jīng)來源有限，因而臨床上迫切需要更安全有效的治療策略。近年來組織工程化神經(jīng)為提高長節(jié)段周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)帶來

2、了新希望，因此，眾多學(xué)者不斷探尋用其他移植材料來修復(fù)神經(jīng)缺損，如何模擬神經(jīng)再生的微環(huán)境，選擇合適的支架材料，充分發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)因子和種子細(xì)胞的趨化作用，構(gòu)建出復(fù)合型神經(jīng)導(dǎo)管以支持長距離神經(jīng)缺損修復(fù)，是目前的研究熱點(diǎn)。
　　 二、目的
　　 本課題研究從仿生設(shè)計(jì)的角度考慮，首先以神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)與組成的分析研究為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并制備了RGD多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）(簡稱PRGD)，然后綜合PRGD、聚乳酸(PDLL

3、A)、β-磷酸三鈣(β-TCP)幾種材料優(yōu)點(diǎn)將它們制成含有神經(jīng)生長因子的復(fù)合型神經(jīng)導(dǎo)管，通過體外生物學(xué)評價(jià)和動物實(shí)驗(yàn)評估其用于修復(fù)大動物長段周圍神經(jīng)缺損的可能性，并初步用于臨床，評價(jià)其修復(fù)周圍神經(jīng)缺損效果。
　　 三、方法
　　 1、從仿生設(shè)計(jì)的角度考慮，首先以神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)與組成的分析研究為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并合成了RGD多肽接枝的高分子聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）(簡稱PRGD)，以乙酸乙酯為溶劑，分別加入聚乳酸(PDL

4、LA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)以及微量神經(jīng)生長因子(NGF)，經(jīng)超聲波分散，磁力攪拌，采用溶劑揮發(fā)法制備PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導(dǎo)管。
　　 2、采用直接接觸法將材料與RSC96細(xì)胞共培養(yǎng)，研究PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導(dǎo)管與雪旺細(xì)胞的相容性。掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料表面的黏附與鋪展情況，用ELISA法對復(fù)合材料NGF緩釋性能進(jìn)行測定，并繪制復(fù)合材料的NGF釋放曲線。
　　 3、

5、健康成年雜種犬12只，雙側(cè)后肢建立30mm腓總神經(jīng)缺損模型，左后肢用新型人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行橋接修復(fù)，右后肢用自體神經(jīng)移植修復(fù)，術(shù)后分籠喂養(yǎng)，觀察切口愈合情況及步態(tài)。
　　 4、術(shù)后3、6、9個(gè)月分別在導(dǎo)管組實(shí)驗(yàn)側(cè)小腿脛前取脛骨前肌肌纖維，對靶肌肉石蠟包埋行HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察，術(shù)后9個(gè)月在麻醉下對雙側(cè)肢體行神經(jīng)電生理檢查，記錄潛伏期、波幅并計(jì)算神經(jīng)傳導(dǎo)速度，分批處死動物，對再生神經(jīng)及靶肌肉進(jìn)行組織學(xué)檢查，最后處死動物取雙側(cè)肢體再

6、生的腓總神經(jīng)標(biāo)本，分別行石蠟包埋和樹脂包埋，分別在光鏡和電鏡下對移植段神經(jīng)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察及超微結(jié)構(gòu)測定。術(shù)后第9個(gè)月時(shí)將體內(nèi)神經(jīng)導(dǎo)管材料取出，觀察其大體形態(tài)，表面血管化及組織生長情況，掃描電鏡觀察分析導(dǎo)管微觀結(jié)構(gòu)變化。
　　 5、在大量動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，制定了產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)，并通過了國家醫(yī)療器械天津檢測中心的檢測后，應(yīng)用可吸收誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)材料修復(fù)人類粗大周圍神經(jīng)缺損，術(shù)后2周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月規(guī)律隨訪，觀察神經(jīng)功能恢復(fù)情況

7、。
　　 四、結(jié)果
　　 1、成功制備出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導(dǎo)管，外觀呈乳白色，無嗅，無味。材料表面光滑、無裂紋、無毛刺，質(zhì)地柔軟，可折彎，易于縫合。體外培養(yǎng)與RSC96細(xì)胞具有較好的細(xì)胞親和性，并可持續(xù)釋放NGF30天以上。
　　 2、動物實(shí)驗(yàn)術(shù)后大體觀察:術(shù)后2周患肢足背出現(xiàn)不同程度紅腫、潰瘍，一月后傷口自行愈合。術(shù)后患肢即出現(xiàn)明顯背伸活動受限，小腿脛骨前肌逐漸萎縮。手術(shù)切口處均(I)

8、期愈合，局部無紅腫、滲液，無異物反應(yīng)。術(shù)后3個(gè)月時(shí)小腿脛骨前肌萎縮的肌肉開始恢復(fù)。
　　 3、電生理檢測:術(shù)后9個(gè)月刺激神經(jīng)干，記錄能引起各組動作電位的潛伏期、波幅并計(jì)算出傳導(dǎo)速度。術(shù)后9個(gè)月雙側(cè)均可引出復(fù)合肌動作電位。導(dǎo)管組與自體組比較傳導(dǎo)速度及潛伏期無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4、組織形態(tài)學(xué)觀察:導(dǎo)管組脛骨前肌術(shù)后3、6、9個(gè)月標(biāo)本HE染色見術(shù)后3個(gè)月時(shí)肌纖維直徑明顯變小，細(xì)胞核多，染色反應(yīng)增強(qiáng)，肌束間見較

9、多結(jié)締組織，3個(gè)月后萎縮的肌纖維逐漸開始恢復(fù)。術(shù)后9個(gè)月導(dǎo)管內(nèi)有連續(xù)性再生神經(jīng)組織通過，再生神經(jīng)飽滿，表面可見營養(yǎng)血管爬行生長。亞甲藍(lán)髓鞘染色:再生神經(jīng)近端:神經(jīng)纖維分布均勻，密度較前增加，髓鞘增厚:中端:再生神經(jīng)形成大小不等神經(jīng)束，神經(jīng)束內(nèi)可見分隔，髓鞘較薄，其間有豐富結(jié)締組織;遠(yuǎn)端:神經(jīng)纖維呈區(qū)域分散狀，形態(tài)較規(guī)則，髓鞘較薄。圖像定量分析:導(dǎo)管組與自體組兩組有髓神經(jīng)纖維軸突直徑、髓鞘厚度相比較均無顯著性差異（P＞0.05），差異均無

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)見術(shù)后9個(gè)月時(shí)再生神經(jīng)遠(yuǎn)、近、中端均可見成熟神經(jīng)纖維，髓鞘厚，軸突增粗，形態(tài)較成熟，髓鞘板層清晰，微絲微管豐富，偶可見雪旺細(xì)胞包繞軸突，可見部分無髓神經(jīng)纖維散在分布。
　　 5、臨床試驗(yàn)隨訪結(jié)果:術(shù)后所有患者傷口均I/甲愈合，無局部炎癥、過敏癥狀（局部紅腫、皮疹、瘙癢）。生命征平穩(wěn)，血常規(guī)、肝腎功能、血沉、C反應(yīng)蛋白等均未見有臨床意義的數(shù)值，無相關(guān)不良反應(yīng)事件發(fā)生。肌電圖檢查:術(shù)后3個(gè)月于支配

11、肌肉即可記錄到再生信號，部分感覺神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)正常，至第6個(gè)月時(shí)肢體能恢復(fù)部分運(yùn)動功能，初步應(yīng)用近期效果令人滿意。
　　 五、結(jié)論
　　 1、通過對天然神經(jīng)基底膜成分的仿生，成功制備出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導(dǎo)管，體外實(shí)驗(yàn)表明該材料具有良好的生物相容性和細(xì)胞親和性，并能持續(xù)釋放NGF達(dá)30天。
　　 2、PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管能成功修復(fù)犬長段周圍神經(jīng)缺損，修復(fù)效