活化T細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子C4在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管生成中的作用.pdf

1、研究目的：1.通過(guò)免疫組化單染及雙染方法分別從組織水平及細(xì)胞水平了解NFATc4在RA關(guān)節(jié)滑膜組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。 2.通過(guò)分析滑膜NFATc4的表達(dá)與滑膜各項(xiàng)病理學(xué)評(píng)分之間的關(guān)系，了解NFATc4與RA滑膜病理學(xué)改變的關(guān)系。 3.通過(guò)分析滑膜NFATc4的表達(dá)與滑膜病理血管生成評(píng)分、滑膜微血管計(jì)數(shù)、滑膜VEGF表達(dá)之間的關(guān)系，了解NFATc4在RA滑膜血管生成中的可能作用。 4.通過(guò)分析滑膜血管內(nèi)皮

2、細(xì)胞中NFATc4的表達(dá)與滑膜病理血管生成評(píng)分、滑膜微血管計(jì)數(shù)及滑膜VEGF表達(dá)之間的關(guān)系，了解RA滑膜血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的NFATc4在滑膜血管生成中的意義。 材料和方法：1.滑膜標(biāo)本來(lái)源及分組43例滑膜標(biāo)本，分為四組，其中RA組11例，OA組17例，TA組6例，正常對(duì)照組9例。所有滑膜標(biāo)本均取自關(guān)節(jié)鏡手術(shù)及關(guān)節(jié)置換術(shù)。 2.標(biāo)本處理滑膜組織離體后立即用4℃的10％中性福爾馬林固定，24小時(shí)后予常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切

3、片，切片厚度為4μm，分別做HE染色和免疫組化染色。 3.免疫組化方法3.1免疫組化單染方法采用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SP)免疫組化方法進(jìn)行單染，一抗包括NFATc4(工作濃度為1：100)、VEGF(工作濃度為1：250)和CD31(內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體，工作濃度為1：30)。 3.2免疫組化雙染方法先采用SP免疫組化法行NFATc4染色，然后再用堿性磷酸酶(AP)免疫組化法行CD31染色。 4.結(jié)果判斷4

4、.1病理學(xué)評(píng)分光鏡下觀察滑膜HE染色結(jié)果。在40×高倍鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)有完整滑膜組織的視野進(jìn)行半定量評(píng)分。計(jì)算5個(gè)視野評(píng)分的平均值作為最終評(píng)分。評(píng)分內(nèi)容包括滑膜襯里層增生、襯里下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血管生成的情況。襯里層評(píng)分：少于3層(0分)，3～4層(1分)，5～6層(2分)，6層以上(3分)。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分：沒(méi)有浸潤(rùn)(0分)，炎癥細(xì)胞散在浸潤(rùn)(1分)，炎癥細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)(2分)，形成淋巴濾泡或生發(fā)中心(3分)。血管生成評(píng)分：正常(0分

5、)，輕度(1分)，中度(2分)，重度(3分)。將以上三項(xiàng)評(píng)分累計(jì)即為該片病理學(xué)總評(píng)分，每張片最高累計(jì)得分為9分。 4.2免疫組化結(jié)果判斷4.2.1滑膜NFATc4染色結(jié)果判斷NFATc4陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量評(píng)分。在40×高倍鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)有完整滑膜組織的視野分別進(jìn)行滑膜襯里層、襯里下層及細(xì)胞核陽(yáng)性染色評(píng)分，計(jì)算5個(gè)視野評(píng)分的平均值作為最終評(píng)分。將某片襯里層和襯里下層評(píng)分

6、相加為該片滑膜總評(píng)分?；ひr里層及襯里下層具體評(píng)分方法如下：先按陽(yáng)性細(xì)胞比例將無(wú)、1％～25％、26％～50％、51％～75％、76％～100％分別計(jì)為0～4分；再按染色強(qiáng)度將無(wú)、弱、中、強(qiáng)分別計(jì)為0～3分，最后綜合兩部分得分。如某片襯里層有50％的細(xì)胞呈中等陽(yáng)性染色，則該片襯里層計(jì)分為2×2=4分；襯里下層有20％的細(xì)胞呈弱陽(yáng)性，則該片襯里下層計(jì)分為：1×2=2；該片滑膜總得分為4+2=6。 細(xì)胞核陽(yáng)性染色具體評(píng)分方法為：分別

7、計(jì)算襯里層、襯里下層陽(yáng)性細(xì)胞中胞核染色陽(yáng)性的比例。 4.2.2滑膜VEGF染色結(jié)果判斷VEGF陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色或棕褐色。按上述方法根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度對(duì)滑膜襯里層、襯里下層VEGF染色進(jìn)行半定量評(píng)分。 4.2.3滑膜CD31染色結(jié)果判斷及滑膜微血管計(jì)數(shù)CD31陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色或棕褐色。根據(jù)CD31陽(yáng)性染色的小血管進(jìn)行滑膜微血管計(jì)數(shù)(MVC)。在4×視野下找出5個(gè)陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞密集的區(qū)域，然后每個(gè)區(qū)域在2

8、0×視野(0.74mm2)下計(jì)數(shù)，取5個(gè)區(qū)域的平均值為最終MVC值。注意：①直徑大于或等于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管或管壁有平滑肌的血管不作為微血管；②獨(dú)立的典型血管內(nèi)皮細(xì)胞著色，但尚未形成管腔，可作為新生微血管來(lái)計(jì)數(shù)；③聚集成簇的內(nèi)皮細(xì)胞或微血管作為一個(gè)單位計(jì)數(shù)。 4.2.4免疫組化雙染結(jié)果判斷及滑膜血管內(nèi)皮細(xì)胞NFATc4的免疫組化評(píng)分NFATc4陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色，CD31陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈淡紅色或紫紅色，NFA

9、Tc4及CD31均為陽(yáng)性的細(xì)胞胞漿呈深紅色或黑色。 滑膜血管內(nèi)皮細(xì)胞NFATc4的表達(dá)采用定量評(píng)分。首先在低倍鏡下找出血管較密集的5個(gè)區(qū)域，然后在40×視野下計(jì)算每個(gè)區(qū)域CD31陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞中NFATc4同時(shí)陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞的比例。取5個(gè)區(qū)域的平均值為最后評(píng)分。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有的數(shù)據(jù)處理均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示；多組問(wèn)均數(shù)的比較采用單因素方差分析；半定量資

10、料兩組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)；對(duì)兩組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析。顯著性水準(zhǔn)為0.05。 小結(jié)：1.RA滑膜襯里下層NFATc4的表達(dá)較非RA滑膜及正常滑膜明顯增多，其表達(dá)程度與滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)呈顯著正相關(guān)，提示RA滑膜襯里下層NFATc4表達(dá)上調(diào)且與滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)。 2.RA滑膜襯里下層NFATc4的表達(dá)與滑膜病理血管生成評(píng)分、滑膜微血管計(jì)數(shù)及滑膜襯里下層VEGF的表達(dá)呈