磷酸鈣-聚合物復(fù)合納米?；蜻f送系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的：制備一類可用于基因遞送的非病毒載體——磷酸鈣/聚合物復(fù)合納米粒，并對(duì)其理化性質(zhì)和體內(nèi)外轉(zhuǎn)染活性進(jìn)行了研究，評(píng)價(jià)其應(yīng)用于基因遞送的可行性。
　　 方法：通過多種方法制備出高分子聚合物聚乙二醇-聚乳（mPEG-PLA）納米粒、聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸-聚賴氨酸共聚物（mPEG-PLGA-PLL）納米粒、陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體羧甲基殼聚糖季銨鹽納米粒（CPL）以及二者分別與磷酸鈣復(fù)合后的復(fù)合納米粒。通過用粒徑分析儀測(cè)定其粒徑分布、

2、表面電位(Zeta電位)，MTT試驗(yàn)研究殼聚糖納米基因載體對(duì)人成纖維細(xì)胞L929、人卵巢癌細(xì)胞HO8901和人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒作用，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞攝取對(duì)各種納米粒進(jìn)行初步篩選并確定DNA與納米粒的最佳結(jié)合質(zhì)量比。通過DNase l保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究DNA復(fù)合納米顆粒對(duì)所攜帶基因的保護(hù)作用。體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是本研究的核心部分，通過倒置熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀、熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)對(duì)納米粒的轉(zhuǎn)染活性進(jìn)行定性和定量的評(píng)價(jià)，綜合評(píng)估并

3、優(yōu)選出細(xì)胞毒性小且轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高的納米材料。通過考察納米粒在不同荷瘤裸鼠中的組織分布，評(píng)價(jià)納米粒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率和組織靶向性。
　　 結(jié)果：制備的納米粒粒徑均分布在100-150nm左右，且分布范圍窄，大小均一。mPEG-PLA納米粒、mPEG-PLGA-PLL納米粒、CPL納米粒表面均帶有正電荷，而復(fù)合納米粒的正電荷明顯低于高分子納米粒本身的電荷數(shù)。通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析復(fù)合納米粒結(jié)合DNA分子的能力。PLA -mPEG納米粒

4、和mPEG-PLGA-PLL納米粒結(jié)合DNA能力較弱，CPL納米粒具有相對(duì)較好的DNA結(jié)合能力，與磷酸鈣復(fù)合后結(jié)合DNA的能力增強(qiáng)，其中CaP/OQCMC (0.1:1)（磷酸鈣/十八烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽）在質(zhì)量比為1:2時(shí),可以與DNA分子結(jié)合。通過MTT實(shí)驗(yàn)可知，mPEG-PLA和mPEG-PLGA-PLL在濃度為200μg/ml時(shí)細(xì)胞生存率仍為90％以上，二者細(xì)胞毒性較小。當(dāng)OQCMC在20μg/ml時(shí)，L929細(xì)胞生存率在6

5、0-70％，而lipofectamine 2000已降至30％。OQCMC與磷酸鈣復(fù)合后，其細(xì)胞毒性大大降低，安全濃度大大提高。CaP/OQCMC在濃度為500μg/ml時(shí)，L929細(xì)胞的生存率仍70％左右。CaP/OQCMC(0.2:1)納米粒可迅速進(jìn)入細(xì)胞，并在1h時(shí)達(dá)到頂峰，其細(xì)胞攝取存在時(shí)間依賴性。對(duì)于不同的細(xì)胞同樣的納米粒的優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件是不同的。通過單因素分析和轉(zhuǎn)染正交試驗(yàn)，得到293T、PC-3和MCF-7細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件

6、。對(duì)于293T細(xì)胞，當(dāng)質(zhì)粒的量為0.8μg，DNA與CaP/OQCMC (0.2:1)納米粒質(zhì)量比為1:2，觀察時(shí)間為72h時(shí)，轉(zhuǎn)染強(qiáng)度最高。對(duì)于PC-3細(xì)胞，當(dāng)質(zhì)粒的量為1.6μg，DNA與CaP/OQCMC (0.2:1)納米粒質(zhì)量比為1:1，觀察時(shí)間為96h時(shí)，轉(zhuǎn)染強(qiáng)度最高。對(duì)于MCF-7細(xì)胞，當(dāng)質(zhì)粒的量為0.8μg，DNA與CaP/OQCMC (0.2:1)納米粒質(zhì)量比為1:1，觀察時(shí)間為48h時(shí)，轉(zhuǎn)染強(qiáng)度最高。十四烷基-羧甲基