抗凋亡蛋白BcL-2在自噬調(diào)控以及細胞生存中的機制研究.pdf

1、目的：抗凋亡蛋白Bcl-2在急性饑餓時，通過與自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1的相互作用，抑制Beclin1誘導的自噬，但是在某些情況下，Bcl-2的過表達并不能抑制自噬活性，因此抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬之間的關(guān)系有待進一步研究。本研究的目的是探討抗凋亡蛋白Bcl-2在自噬調(diào)控中的作用及其在細胞生存和死亡中的意義。
　　 方法：利用血清饑餓和自噬激動劑雷帕霉素(Rapamycin)在人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y中，激活自噬，West

2、ern檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1，LC3，p62和CathepsinD，確定自噬激活模型成功；檢測Bcl-2家族蛋白變化；利用siRNAKnockdownBcl-2，或者應(yīng)用Bcl-2的小分子抑制劑拮抗Bcl-2的功能，用MTT法檢測細胞在饑餓下的活力變化，用Annexin-V/PI檢測細胞凋亡的改變；加入自噬不同階段的抑制劑,3-MA，E64D和BafilomycinA1，檢測在Bcl-2被下調(diào)或被小分子抑制劑拮抗時，血清饑餓誘導

3、的自噬對細胞活力的影響。
　　 結(jié)果：利用血清饑餓SH-SY5Y細胞6，12，24,36,48小時，Western檢測自噬蛋白Beclin1，LC3，CathepsinD和p62，結(jié)果顯示Beclinl，LC3和CathepsinD在血清饑餓時均上調(diào)，而自噬底物p62在6小時一過性下調(diào)，提示自噬被激活；用自噬激動劑雷帕霉素同樣激活了自噬；在自噬被激活時，檢測到抗凋亡蛋白Bcl-2上調(diào)；用siRNA干擾Bcl-2蛋白表達水平，檢測

4、到LC3無變化，加入溶酶體抑制劑氯化銨，LC3出現(xiàn)堆積，并且自噬底物p62被進一步降解，提示自噬流量進一步增強；在Bcl-2被下調(diào)時，或者應(yīng)用小分子抑制劑HA14-1和ABT-737拮抗Bcl-2的功能活性時，MTT結(jié)果顯示，血清饑餓進一步使細胞活力下降，AnnexinV/PI結(jié)果顯示細胞發(fā)生早期和晚期凋亡；泛caspase抑制劑Z-VAD阻斷細胞死亡證實部分細胞死亡是凋亡性的；應(yīng)用自噬不同階段的抑制劑，E64D和巴普洛霉素(Bafil

5、omycinA1)抑制自噬，可以挽救血清饑餓導致的部分細胞死亡。這些結(jié)果表明，伴隨自噬激活而上調(diào)的Bcl-2蛋白能夠限制自噬的過度激活和保護營養(yǎng)應(yīng)激下的細胞死亡，當Bcl-2被下調(diào)時，自噬進一步激活，并且細胞發(fā)生死亡，這種死亡是凋亡性的，同時又是自噬性，因為caspase的抑制劑和自噬的抑制劑都能夠挽救部分細胞死亡。
　　 結(jié)論：營養(yǎng)剝奪誘導的自噬激活在生理條件下是保護性的，當Bcl-2下調(diào)時，抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白，抗自噬蛋白