MiRNA let-7與MMP-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、目的
　　 分析非小細(xì)胞肺癌中MicroRNA let-7與基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達(dá)及臨床意義,探討其在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及發(fā)展中的作用及二者的相關(guān)性。
　　 材料與方法
　　 臨床病例資料收集:收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科2010年6月至2011年3月46例非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)切除的肺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織(腫瘤遠(yuǎn)端5cm以外或手術(shù)邊緣經(jīng)病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞),其中男性20例,女性26例,年齡

2、46-71歲,中位年齡58歲,平均62歲。鱗癌13例,腺癌33例。留取標(biāo)本已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并在每次采集標(biāo)本前均由患者簽署知情同意書。
　　 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定:采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P法)檢測(cè)MMP-2蛋白的表達(dá),以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。結(jié)果判定:根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞比例及著色深淺計(jì)分,著色細(xì)胞比例1/3以下為1分:1/3-2/3為2分;2/3以上為3分。著色深度:無著色為0分;淺黃色

3、為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。然后根據(jù)二者乘積作為每一例的積分,積分＜4分為陰性;≥4分為陽性。
　　 蛋白免疫印跡及結(jié)果判定:收集組織(包括肺癌組織及配對(duì)的癌旁組織),勻漿,離心,Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。12%SDS-PAGE電泳,恒定電壓100V下轉(zhuǎn)膜2小時(shí),室溫封閉1小時(shí)。用TBST將MMP-2-抗稀釋至1:200,倒入已放好膜的孵育袋中4℃過夜。用TBST按1:10000配制二抗,室溫下孵育2小時(shí),E

4、CL發(fā)光。測(cè)量灰度值,統(tǒng)計(jì)分析肺癌組和癌旁組織組中目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值比值的差異性。
　　 實(shí)時(shí)定量PCR:收集組織(包括肺癌組織及配對(duì)的癌旁組織)使用試劑盒抽取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用反應(yīng)體系包括SYBRPremixExTap12.50μl、引物各1μl、DNA模板20μl、ROXReferenceDye(50x)0.5μl、dH2O8μ1。反應(yīng)條件為95℃,5S;60℃,30S;40個(gè)循環(huán)。U6和B-acti

5、n為內(nèi)參照,運(yùn)用2-△△CT法計(jì)算檢測(cè)let-7和MMP-2相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果
　　 MMP-2免疫組化染色的陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒,為漿表達(dá)。MMP-2在46例肺鱗癌和腺癌中陽性表達(dá)為30例(65.2%),在癌旁組織為7例(15.2%),統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=24.3,P＜0.001)。MMP-2的表達(dá)與腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(x2=4.28,P＜0.05;x=6.10,P＜0.0

6、5),而與病人的年齡、性別及病理分型統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示無相關(guān)性。
　　 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,肺癌組織相對(duì)表達(dá)量為3511.2±692.4,癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量為1437.2±382.5,肺癌組織中MMP-2蛋白的表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(t=10.698,p＜0.001)。
　　 實(shí)時(shí)定量PCR示在46例肺鱗癌和腺癌中與配對(duì)的癌旁組織比較let-7低表達(dá)的為29例(63.0%),MMP-2高表達(dá)的為31例(67.4%)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯

7、示let-7和MMP-2在非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織中的差異性表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在46例NSCLC組織中,let-7與MMP-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05,rs=-0.433)。
　　 結(jié)論
　　 MMP-2及Let-7在肺癌中的表達(dá)存在異常,提示二者可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展的過程。MMP-2的異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期相關(guān),提示MMP-2在肺癌的發(fā)展中有一定促進(jìn)作用。Let-7的低表達(dá)可能引起MMP-2表達(dá)的