siRNA干擾Rac1基因表達(dá)及其抑制大鼠視網(wǎng)膜新生血管生成機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 在眼部疾病中，血管增生過(guò)度是一大類致盲性眼病的根本原因，其中視網(wǎng)膜新生血管性疾病占據(jù)較大比例。視網(wǎng)膜新生血管的生長(zhǎng)及其所致的出血、滲出、增生等是多種致盲眼病的主要病理過(guò)程。血管新生是多種分子共同作用的結(jié)果，而已往的研究多是針對(duì)單分子來(lái)控制血管新生，、這些方法雖然顯示出一定抑制作用，但畢竟單分子作用是微弱的，故抗血管新生的作用也是有限的。近年來(lái)的研究表明Racl可能是調(diào)控多種血管生成相關(guān)因素的關(guān)鍵分子。為探討Racl對(duì)于視

2、網(wǎng)膜新生血管的調(diào)控作用，本研究采用RNA，干擾技術(shù)抑制Racl基因表達(dá)，觀測(cè)其對(duì)視網(wǎng)膜新生血管生成及其相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的抑制作用。 方法： 1．第一部分Racl—siRNA表達(dá)載體構(gòu)建 1.1以人Racl mRNA為模板，設(shè)計(jì)與大鼠同源的、針對(duì)Racl基因編碼區(qū)的Racl—siRNA序列，并在體外轉(zhuǎn)錄合成。 1.2雙酶切pSUPER質(zhì)粒，與Racl—siRNA鏈連接，構(gòu)建Racl—siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化

3、感受態(tài)細(xì)胞(E.coli)后采用菌落PCR、雙酶切(Bgl lI和HindⅢ)進(jìn)行分離純化，Sanger序列分析法進(jìn)行載體鑒定。 1.3將構(gòu)建的載體對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察各載體的轉(zhuǎn)染效果。收集HeLa細(xì)胞進(jìn)行RT—PCR，篩選出抑制效果較好的載體，抽提后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 2. 第二部分大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型的建立 2.1視網(wǎng)膜新生血管模型建立：健康成年SD大鼠50只，常規(guī)麻醉后，尾靜脈注射虎紅，532nm激

4、光光凝視網(wǎng)膜主要靜脈，建立視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型。 2.2光凝術(shù)后2周，采用心內(nèi)注射FITC—dextran，視網(wǎng)膜鋪片法觀察新生血管生成的情況。 3. 第三部分Racl—siRNA抑制大鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 3.1大鼠玻璃體腔載體轉(zhuǎn)染情況檢測(cè)：玻璃體腔轉(zhuǎn)染重組載體和空白載體后4天，行眼球冰凍切片。熒光顯微鏡下觀察兩種載體對(duì)活體視網(wǎng)膜組織的轉(zhuǎn)染情況。 3.2采用50只成年SD大鼠，光動(dòng)力法誘導(dǎo)

5、視網(wǎng)膜靜脈阻塞后，玻璃體腔轉(zhuǎn)染Racl—siRNA載體作為基因干預(yù)組；另眼注射空白載體作為空白對(duì)照組；同時(shí)采用正常同齡大鼠25只單眼玻璃體腔內(nèi)注射Racl—siRNA載體作為空白干預(yù)組。 3.3 2周后對(duì)3組動(dòng)物進(jìn)行心內(nèi)灌注FITC—dextran，視網(wǎng)膜鋪片，檢測(cè) 視網(wǎng)膜新生血管生成情況。3.4取出3組大鼠眼球，常規(guī)石蠟包埋，矢狀面連續(xù)切片，HE染色后顯微鏡下觀測(cè)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的形態(tài)改變，計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)，進(jìn)

6、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 3.5免疫組織化學(xué)法從蛋白水平檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)血管生成相關(guān)因子：Racl、VEGF、HIF-1α和NF-kB的表達(dá)情況。檢測(cè)平均光密度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 3.6提取各組大鼠視網(wǎng)膜總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)視網(wǎng)膜中血管生成因子：Racl、VEGF、HIF-1α和NF-kB的含量，進(jìn)行數(shù)據(jù)歸納和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1. 第一部分，Racl-siRNA表達(dá)載體構(gòu)建 1.

7、1成功構(gòu)建3種Racl-siRNA重組載體并進(jìn)行了分離純化，獲得高度純化的重組載體。載體序列鑒定驗(yàn)證所得載體序列與設(shè)計(jì)序列完全吻合。 1.2采用HeLa細(xì)胞對(duì)重組載體的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行初步檢測(cè)。結(jié)果顯示構(gòu)建的3種重組載體對(duì)HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率都高達(dá)70％以上。 1.3收集HeLa細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)3種重組載體對(duì)Racl mRNA的抑制率。結(jié)果顯示與空白載體相比，3種重組載體均有明顯的抑制效果，其中載體1

8、和載體2抑制效果較好。 1.4綜合各方面條件，篩選轉(zhuǎn)染率和抑制率較高的載體2，大量抽提后為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。 2．第二部分大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型的建立 2.1光凝手術(shù)時(shí)，可見(jiàn)視網(wǎng)膜靜脈內(nèi)明顯黑色血栓形成，靜脈粗細(xì)不均，遠(yuǎn)端靜脈迂曲、擴(kuò)張。 2．2光凝后第2天行眼底檢查發(fā)現(xiàn)：視網(wǎng)膜主要靜脈迂曲粗大、可見(jiàn)栓塞引起出血。 2.3 2周后FITC-dextran心內(nèi)灌注視網(wǎng)膜鋪片顯示光凝眼與對(duì)照眼視

9、 網(wǎng)膜血管形態(tài)：對(duì)照眼大鼠視網(wǎng)膜見(jiàn)深淺兩層血管網(wǎng)，從視神經(jīng)周圍發(fā)出走向視網(wǎng)膜周邊。淺層血管呈放射狀分布，深層血管呈網(wǎng)狀分布。光凝眼視網(wǎng)膜血管形態(tài)和分布發(fā)生明顯改變，失去正常的放射狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大量新生血管芽和新生血管枝，視網(wǎng)膜血管雜亂、縱橫交錯(cuò)、熒光素滲漏。 3.第三部分Racl-siRNA抑制大鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 3.1轉(zhuǎn)染4天后，各選取2只大鼠行眼球冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)視網(wǎng)膜區(qū)域呈

10、現(xiàn)綠色熒光。從而證明重組載體和空白載體對(duì)活體視網(wǎng)膜組織的轉(zhuǎn)染率都較高。 3．2光凝2周后FITC-dextran心內(nèi)灌注視網(wǎng)膜鋪片發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組視網(wǎng)膜血管雜亂，縱橫交錯(cuò)，產(chǎn)生大片狀新生血管，大量熒光素滲漏。 基因干預(yù)組僅見(jiàn)小片狀新生血管網(wǎng)，少量熒光素滲漏?？瞻赘深A(yù)組呈正常血管形態(tài)。 3.3基因干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜切片中，突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞平均數(shù)與空白對(duì)照組和空白干預(yù)組比較，兩兩間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

11、 3．4視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色顯示：基因干預(yù)組、空白對(duì)照組與空白干預(yù)組相比，視網(wǎng)膜中Racl、VEGF、HIF-1 α和NF－kB的表達(dá)較強(qiáng)，空白對(duì)照組最強(qiáng)。平均光密度值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.5 RT-PCR檢測(cè)Racl、VEGF、HIF-1α和NF-<,к>B在基因干預(yù)組和空白對(duì)照組中與空白干預(yù)組相比表達(dá)較強(qiáng)。但基因干預(yù)組與空白對(duì)照組相比，上述4個(gè)因子表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

12、 結(jié)論： 本研究表明：體外重組的Racl—siRNA表達(dá)載體能有效的抑制體內(nèi)視網(wǎng)膜新生血管的生成，并且從蛋白水平、基因水平證明能下調(diào)多種視網(wǎng)膜內(nèi)與血管生成相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平。其作用機(jī)制為：干擾RNA技術(shù)抑制Racl基因表達(dá)，從而抑制HIF—1α表達(dá)，阻斷了血管新生相關(guān)生長(zhǎng)因子的上游信號(hào)途徑，下調(diào)了它們的表達(dá)，從而抑制新生血管生成。同期觀察未見(jiàn)重組載體對(duì)視網(wǎng)膜有明顯的毒副作用。本研究為視網(wǎng)膜新生血管性疾病的基因治療方案，