HIF-1α和VEGF小干擾RNA抑制鼠視網(wǎng)膜新生血管的研究.pdf

1、第一章 目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)小片段干擾性RNA(siRNA)對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響。 方法：構(gòu)建HIF-1αsiRNA重組質(zhì)粒。將體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)分成常氧(20％)組和低氧(1％)組。低氧組中，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000(LF2000)分別轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒(空載體組)、HIF-1α si

2、RNA(HIF-1α組)、VEGF165 siRNA(VEGF組)和HIF-1α siRNA+VEGF165 siRNA(共轉(zhuǎn)染組)，低氧組中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為低氧對(duì)照組。常氧組細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后重組質(zhì)粒的表達(dá)；RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α和VEGF基因和蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：成功構(gòu)建HIF-1α siRNA重組質(zhì)粒。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，HIF-1α

3、 siRNA和VEGF165 siRNA重組質(zhì)粒有表達(dá)。細(xì)胞HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平：常氧組細(xì)胞HIF-1α mRNA有表達(dá)，但未見明顯HIF-1α蛋白表達(dá)，低氧對(duì)照組和空載體組細(xì)胞HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)較常氧組增強(qiáng)，而HIF-1α組較低氧對(duì)照組明顯減弱(P<0.01)，mRNA抑制效率為59.8％。細(xì)胞VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平：常氧組細(xì)胞僅見微弱的VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，而缺氧后表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.

4、01)；HIF-1α組、VEGF組和共轉(zhuǎn)染組表達(dá)較低氧對(duì)照組減弱(P<0.01)，mRNA抑制效率分別為39.7％、68.1％和82.3％，其中共轉(zhuǎn)染組抑制效果最明顯。 結(jié)論：HIF-1α和VEGF165 siRNA能有效抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α和VEGF的表達(dá)。 第二章：HIF-1α和VEGF小干擾RNA對(duì)鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制 目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEG

5、F)小片段干擾性RNA(siRNA)對(duì)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用。 方法：C57BL/6J小鼠玻璃體腔注射pEGFP-N1-脂質(zhì)體復(fù)合物，1d后視網(wǎng)膜鋪片觀察GFP的表達(dá)。選7d齡C57BL/6J小鼠117只，其中21只為正常組；另96只建立氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管模型，并隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、空載體組和基因治療組(HIF-1α組、VEGF組和共轉(zhuǎn)染組)。于出艙前1d，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，向空載體組小鼠玻璃體腔注射空載體質(zhì)

6、粒；HIF-1α組注射HIF-1αsiRNA；VEGF組注射VEGF165 siRNA；共轉(zhuǎn)染組注射HIF-1α siRNA+VEGF165siRNA。RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后重組質(zhì)粒的表達(dá)；采用熒光造影視網(wǎng)膜鋪片方法觀察血管形態(tài)變化；組織切片觀察并計(jì)算突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)；RT-PCR、免疫組化和Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜HIF-1α和VEGF的表達(dá)。 結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α s

7、iRNA和VEGF165siRNA重組質(zhì)粒有表達(dá)；pEGFP-N1經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜后1d即可見GFP表達(dá)；視網(wǎng)膜鋪片可見基因治療組較模型對(duì)照組和空載體組新生血管叢明顯減少，熒光滲漏明顯減輕，共轉(zhuǎn)染組效果最明顯；組織切片可見基因治療組較其他三組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；視網(wǎng)膜HIF-1αmRNA及蛋白表達(dá)水平：模型對(duì)照組和空載體組較正常組上調(diào)，而HIF-1α組較模型對(duì)照組下調(diào)，抑制效率分別