第三者骨髓間充質干細胞對MHC不相合造血干細胞移植后移植物抗腫瘤作用影響的實驗研究.pdf

1、目的：異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是目前治愈惡性血液系統(tǒng)疾病最有效的手段之一。移植物抗腫瘤(GVT)效應是allo-HSCT后供者免疫細胞清除腫瘤細胞和防止復發(fā)的主要機制。GVHD和GVT作用常同時存在，在一些減輕GVHD的治療方法影響下，GVT作用也被削弱。間充質干細胞(MSC)和造血干細胞(HSC)聯(lián)合移植能夠改善造血微環(huán)境促進造血干細胞的植入，發(fā)揮有效的免疫抑制作用，減輕GVHD。本研究利用純系小鼠C57BL/6H-

2、2b→BALB/cH-2d建立MHC不相合造血干細胞移植荷瘤動物模型，將封閉群KM小鼠骨髓MSC經體外培養(yǎng)后與供鼠的脾臟及骨髓細胞進行聯(lián)合移植，探討第三者來源的MSC在促進MHC不相合HSCT后的造血重建、誘導免疫耐受同時，對GVT作用的影響。 方法： 1.實驗動物 清潔級造血干細胞供鼠C57BL/6H-2b (B6)，6～8周齡，雌雄兼用；受鼠BALB/cH-2d，6～8周齡，雌雄兼用；第三者BMMSC供鼠，K

3、M小鼠，6～8周齡，雌雄兼用。以上動物由河北省實驗動物中心提供，合格證編號為803177。飼養(yǎng)于百級層流潔凈動物飼養(yǎng)柜。 2.BMMSCs的培養(yǎng)、擴增將BMMSCs供鼠頸椎脫臼處死，無菌分離小鼠股骨及脛骨，以含F(xiàn)12-DMEM為完全培養(yǎng)基(CCM，含青霉素100μg/ml、鏈霉素100μg/ml、HEPES液0.03mol/L以及20％FBS)沖出骨髓。直接接種于25cm2一次性無菌塑料培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)，

4、每48小時半量換液一次，換液兩次后，改為3-4天全量換液。當貼壁細胞層達到90％以上融合時，以0.25％胰酶消化，傳至第3代以后的細胞，純度＞90％用于移植。 3.制備小鼠脾臟(SPC)及骨髓細胞(BMC)取B6小鼠脫頸椎處死后，無菌分離脾臟、雙側股骨和脛骨。常規(guī)制備SPC及BMC懸液，錐蟲藍計數(shù)，拒染率＞95％，調整至所需細胞濃度備用。 4 B16細胞的體內傳代小鼠黑色素細胞瘤B16購于河北醫(yī)科大學實驗動物學部。常規(guī)培

5、養(yǎng)傳代后，制備1×107/ml細胞懸液，接種于BALB/c小鼠右前腋下，每鼠約1 × 106細胞，在移植當天無菌條件下取出腫瘤塊，并制得單細胞懸液，錐蟲藍計數(shù)，拒染率＞95％；調整細胞濃度至1×10 7/ml備用。 5 MHC不相合造血干細胞移植荷瘤動物模型的建立供受鼠均于移植前3天開始飲用酸化水。將研磨制得的小鼠B16細胞接種于受鼠BALB/c右前腋下，0.1ml/鼠(1×10 6細胞)，24小時后接受60Coγ射線亞致死性全

6、身照射(TBI)8.5Gy,，劑量率0.63Gy/min，預處理后4小時內接受(BMC 5 × 106+SPC 1 × 107)B6/0.2ml/鼠，實驗組同時輸注不同數(shù)量的BMMSCKM/B6，對照組輸注生理鹽水/0.2ml/鼠。 6 動物分組 a.低數(shù)量第三者MSC移植組： B16+TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCKM(5 × 103)→BALB/cb.中數(shù)量第三者MSC移植組： B 16+

7、TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCKM(5 × 104)→BALB/cc.高數(shù)量第三者MSC移植組： B 16+TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCKM(5 × 105)→BALB/cd.高數(shù)量供鼠MSC移植對照組： B 16+TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCB6(5 × 105)→BALB/ce.無MSC移植組： B 16+TBI+(BMC+SPC)B6→BALB/cf. 單純TBI對照

8、組： TBI→BALB/cg.TBI+B16對照組： B 16+TBI→BALB/ch.B16成瘤對照組： B16→BALB/c注：每組動物4～5只(不包括在移植后不同時間活殺，留取標本的動物)，每組實驗重復2次。 7 結果判斷標準 7.1移植失敗：動物死亡時WBC≤1×109/L，或者移植15天后WBC≤1.5×109/L。 7.2 GVHD判斷：WBC＞1.0×109/L并伴有以下癥狀

9、3種以上的動物定為GVHD：精神萎靡，翹毛，脫毛，皮損，腹瀉，弓背，眼炎，體重驟減甚至死亡；d+10天內出現(xiàn)癥狀者為超急性GVHD(saGVHD)：d+10～d+30天出現(xiàn)者為aGVHD。 7.3 腫瘤導致死亡的判斷：動物死亡時WBC＞1.5×109/L，腫瘤明顯增大，破潰壞死，無明顯GVHD表現(xiàn)。 7.4 長期生存：生存時間大于30天記為長期生存。若生存期大于60天按60天計算。 8 移植動物觀察內容移植后每天

10、觀察小鼠進食及精神的狀況，有無aGVHD的表現(xiàn)；每天稱量體重；可觸及的腫瘤出現(xiàn)為腫瘤出現(xiàn)時間，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤大??；記錄小鼠的存活時間及原因。隔日采集小鼠尾靜脈血，計數(shù)WBC數(shù)。擇時取小鼠的肺、肝、小腸進行病理學檢查，并觀察變化和差異。 9 統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理，實驗數(shù)據(jù)采用X±SD表示，多個樣本兩兩比較采用q檢驗(SNK法)，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。繪制Kaplan-Meier生存曲線。