慢病毒介導(dǎo)的VEGF干涉聯(lián)合METH-1抑制血管生成預(yù)防兔耳增生性瘢痕的研究.pdf

1、增生性瘢痕是皮膚損傷后創(chuàng)面愈合的異常結(jié)果,在國(guó)人中的發(fā)病率很高[1],增生性瘢痕的預(yù)防和治療也是整形外科的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一,其常發(fā)生于各種燒、創(chuàng)傷和手術(shù)之后,由于其形成機(jī)制并不十分清楚,目前依然缺乏有效的防治方法[2]。
　　近年來(lái)的研究表明血管化與增生性瘢痕的形成密切相關(guān)[3],血管化過(guò)程中有多種細(xì)胞因子的共同參與,其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是目前已知的作

2、用最強(qiáng)的促血管生成因子之一[4],VEGF的高表達(dá)與增生性瘢痕的形成密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在此理論的基礎(chǔ)上,已經(jīng)設(shè)計(jì)、合成、篩選出了針對(duì)VEGF抑制效果最佳的小干擾RNA片段,并構(gòu)建了該干涉片段的慢病毒載體——慢病毒介導(dǎo)的靶向沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Lentivirus-mediatedsilenceinterferenceVEGF,LV-SiVEGF)[5]。實(shí)驗(yàn)一擬在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上,將LV-SiVEGF基因作用于兔耳增生性瘢痕動(dòng)

3、物模型,通過(guò)對(duì)兔耳組織中增生性瘢痕指數(shù)、成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、血管內(nèi)皮細(xì)胞的檢測(cè),超微結(jié)構(gòu)變化等,探討通過(guò)血管靶向基因治療抑制增生性瘢痕的可行性。
　　同時(shí),我們前期的研究還發(fā)現(xiàn)重組血管生成抑制劑(ProteinscontainingMetalloproteaseandThrombospondindomain-1,METH-1)對(duì)增生性瘢痕也有明顯的抑制作用[6],并構(gòu)建出了METH-1的慢病毒載體——慢病毒介導(dǎo)的重組血管生成

4、抑制劑METH-1(Lentivirus-mediatedMETH-1,LV-METH-1)[7]。因此,實(shí)驗(yàn)二擬在兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型上,觀察穩(wěn)定干擾VEGF的表達(dá)和聯(lián)合應(yīng)用重組血管生成抑制劑METH-1對(duì)兔耳增生性瘢痕形成的影響,通過(guò)對(duì)增生性瘢痕指數(shù)、成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、內(nèi)皮細(xì)胞的檢測(cè)等,深入研究血管靶向基因治療抑制增生性瘢痕形成的可行性,進(jìn)一步探尋對(duì)增生性瘢痕行之有效的防治方法。
　　全文包括兩個(gè)部分:
　　第

5、一部分:靶向沉默VEGF對(duì)兔耳增生性瘢痕的影響
　　目的:探討慢病毒介導(dǎo)的靶向沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子LV-SiVEGF對(duì)兔耳增生性瘢痕形成的影響及其可能的作用機(jī)制,研究血管靶向基因治療對(duì)兔耳增生性瘢痕的預(yù)防作用。方法:以10只日本大耳白兔建立兔耳增生性瘢痕模型,并隨機(jī)選擇兔的左、右耳作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。待創(chuàng)面愈合后,實(shí)驗(yàn)組注射攜帶有干擾序列LV-SiVEGF的重組慢病毒,對(duì)應(yīng)的作為對(duì)照組注射慢病毒介導(dǎo)的空載病毒對(duì)照(Lentivir

6、us-mediatedNo-loadviruscontrol,LV-NC)。創(chuàng)面愈合后第30天取材,觀察對(duì)比各組瘢痕外觀形態(tài)的變化,并對(duì)瘢痕組織進(jìn)行HE染色、Masson染色、CD34染色、VEGF染色、透射電鏡觀察,研究分析靶向沉默兔耳瘢痕組織中VEGF的表達(dá)對(duì)組織內(nèi)增生性瘢痕指數(shù)、組織血管生成、成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組血管靶向基因治療30天后,兔耳增生性瘢痕中微血管生成明顯減少、膠原合

7、成及成纖維細(xì)胞增殖均受到明顯抑制,超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞活性下降。結(jié)論:瘢痕形成早期應(yīng)用LV-SiVEGF基因治療可明顯抑制兔耳增生性瘢痕的形成。
　　第二部分:靶向沉默VEGF與重組血管生成抑制劑METH-1單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兔耳增生性瘢痕的影響
　　目的:探討慢病毒介導(dǎo)的靶向沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子LV-SiVEGF與慢病毒介導(dǎo)的重組血管生成抑制劑LV-METH-1單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兔耳增生性瘢痕形成的影響及其可能的作

8、用機(jī)制,研究血管靶向基因治療對(duì)兔耳增生性瘢痕的預(yù)防作用。方法:選擇20只日本大耳白兔復(fù)制出兔耳增生性瘢痕模型,并隨機(jī)將創(chuàng)面分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組:對(duì)照組、單獨(dú)LV-SiVEGF組、單獨(dú)LV-METH-1組、聯(lián)合應(yīng)用組。待創(chuàng)面愈合后,對(duì)照組注射無(wú)關(guān)的LV-NC空載慢病毒;單獨(dú)LV-SiVEGF組注射攜帶有干擾序列LV-SiVEGF的重組慢病毒;單獨(dú)LV-METH-1組注射攜帶有目的基因LV-METH-1的重組慢病毒;聯(lián)合應(yīng)用組注射攜帶有干擾序列L

9、V-SiVEGF和目的基因LV-METH-1的重組慢病毒。創(chuàng)面愈合后第30天取材,觀察對(duì)比各組瘢痕外觀形態(tài)的變化,并對(duì)瘢痕組織進(jìn)行HE染色、Masson染色、CD34染色、VEGF染色、透射電鏡觀察,研究分析靶向沉默兔耳瘢痕組織中VEGF的表達(dá)對(duì)組織內(nèi)增生性瘢痕指數(shù)、組織血管生成、成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比,單獨(dú)LV-SiVEGF組、單獨(dú)LV-METH-1組、聯(lián)合應(yīng)用組血管靶向基因治療30天后,兔耳增

10、生性瘢痕中微血管生成均有不同程度的減少(血管數(shù)目計(jì)數(shù):對(duì)照組>單獨(dú)LV-METH-1組>單獨(dú)LV-SiVEGF組>聯(lián)合應(yīng)用組)、膠原合成及成纖維細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制(成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù):對(duì)照組>單獨(dú)LV-METH-1組>單獨(dú)LV-SiVEGF組>聯(lián)合應(yīng)用組)。結(jié)論瘢痕形成早期應(yīng)用LV-SiVEGF或/和LV-METH-1進(jìn)行基因治療可明顯抑制兔耳增生性瘢痕的形成,其中,應(yīng)用抑制效果由好到差依次是聯(lián)合應(yīng)用組、單獨(dú)LV-SiVEGF組、