鱉甲煎丸抗大鼠肝纖維化作用及對Ⅳ型膠原和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7的影響.pdf

1、目的:肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是機(jī)體對各種致病因素引起的肝臟慢性損傷的代償性修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化過程中共同的病理途徑，其特點是肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellularmatrix，ECM)的過度增生與沉積。及時治療阻斷肝纖維化能夠降低肝硬化的發(fā)生幾率。近年來研究顯示，中醫(yī)藥在肝纖維化的治療中有一定的優(yōu)勢?；鐾ńj(luò)中藥鱉甲煎丸出自東漢張仲景《金匾要略》，具有消痞化積、活血化瘀、疏肝解郁

2、的功效，可多途徑、多靶點作用于抗肝纖維化的治療。本實驗應(yīng)用鱉甲煎丸對通過四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)建立的肝纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠模型的一般情況，檢測大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)的含量，測定其層粘連蛋白(LN)水平，進(jìn)行肝臟病理學(xué)形態(tài)觀察，檢測大鼠肝組織中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7)、Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)mRNA及其蛋白表達(dá)，探討化瘀通絡(luò)中藥對肝纖維化的治療及其可能作用

3、機(jī)制。
　　方法:河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供清潔級健康雄性SD大鼠56只，體重在330g至410g之間，將其適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分成6組，分別為正常對照組(A)、模型組(B)、西藥秋水仙堿組(C)、化瘀通絡(luò)中藥鱉甲煎丸低劑量組(D)、鱉甲煎丸中劑量組(E)和鱉甲煎丸高劑量組(F)。A組大鼠皮下注射橄欖油，其余各組大鼠皮下注射含40％CCl4橄欖油溶液，每周2次，實驗第1天，每只大鼠按5ml/kg注射，此后每次每只大鼠按3ml

4、/kg注射。同時D、E、F各組大鼠每日分別按中藥鱉甲煎丸0.55g/(kg.d)、1.1g/(kg.d)、2.2g/(kg.d)給予10mL/(kg.d)相應(yīng)藥液灌胃，C組大鼠每日按秋水仙堿0.1mg/(kg.d)給予10mL/(kg.d)灌胃，A、B兩組大鼠每日分別給予等量蒸餾水灌胃。在實驗第6周造模成功后，停止橄欖油或CCl4皮下注射，實驗各組大鼠繼續(xù)給予原劑量藥液或蒸餾水灌胃5周，每日1次。在實驗第11周末，給予各組大鼠禁食12h

5、，應(yīng)用水合氯醛將其逐一麻醉，從心臟穿刺取血，離心分離后取血清，分別測定各組大鼠血清ALT、AST、ALB水平;用放射免疫法檢測各組大鼠血清LN水平;摘取大鼠肝臟，將肝左葉置于4％多聚甲醛溶液中固定，用石蠟將其包埋，HE染色及Masson染色后，光鏡下觀察各組大鼠肝組織的病理形態(tài)學(xué)改變。將肝右葉置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱內(nèi)，用免疫組化法觀察各組大鼠肝組織IGFBP7、Col-Ⅳ蛋白表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse tran

6、scription-polymerasechain reaction RT-PCR)法檢測各組大鼠肝組織中IGFBP7 mRNA、Col-ⅣmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.各組大鼠的一般情況A組大鼠一般情況良好，反應(yīng)機(jī)敏，毛發(fā)旺盛，有光澤，體重持續(xù)增長。其余各組大鼠一般情況較差，皮毛暗淡、松弛，反應(yīng)遲鈍，形體消瘦，脾氣急躁，易激惹，且在實驗過程中均有死亡情況:B組死亡2只大鼠，C、D、E、F組各死亡1只大鼠。
　

7、　2.各組大鼠肝組織的病理形態(tài)學(xué)改變光鏡下，A組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞多為單核，呈條索樣，圍繞中央靜脈放射狀排列。B組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)已破壞，肝細(xì)胞明顯腫脹、廣泛壞死，肝臟匯管區(qū)擴(kuò)大、結(jié)締組織明顯增生并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，形成假小葉。C、D、E、F各組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較為完整、清晰，肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，肝臟匯管區(qū)的纖維結(jié)締組織增生不明顯，形成的假小葉明顯減少。D、E、F各組大鼠肝組織病理改變依次減輕，C組大鼠肝臟病理形態(tài)變化介于B

8、組與D組之間。表明中藥鱉甲煎丸對減輕大鼠肝纖維化的療效確切，且優(yōu)于西藥秋水仙堿。
　　3.各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)ALT、AST和ALB的水平變化各組大鼠血清ALT、AST含量:與A組大鼠相比，B、C、D、E、F各組大鼠血清ALT和AST的含量明顯升高(P＜0.05);與B組大鼠相比，C、D、E、F各組大鼠血清ALT、AST的含量明顯減低(P＜0.05);與C組太鼠相比，D組大鼠血清ALT、AST的含量較之升高（P＜0.05），F(xiàn)組大鼠

9、血清ALT、AST的含量較之明顯降低(P＜0.05)，E組大鼠血清ALT、AST的含量與之比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D、E、F各組大鼠相比，血清ALT、AST的含量差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中D組大鼠含量最高，F(xiàn)組大鼠含量最低，E組大鼠含量居中。
　　各組大鼠血清ALB含量顯示:與A組大鼠相比，B、C、D、E、F各組大鼠血清ALB的含量明顯降低（P＜0.05）;與B組大鼠相比，C、E、F各組大鼠血清A

10、LB的含量明顯升高（P＜0.05），而D組大鼠與其差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;與C組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠血清ALB的含量較之明顯升高(P＜0.05)，D組大鼠血清ALB水平減低(P＜0.05)，E組大鼠與之相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D、E、F各組大鼠血清ALB含量相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中F組大鼠含量最高，E組大鼠次之，D組大鼠含量最低。
　　4.各組大鼠血清LN含量的比較各組大鼠血清LN含量結(jié)

11、果示:與A組大鼠相比，B、C、D、E、F各組大鼠血清LN含量明顯升高(P＜0.05);與B組大鼠相比，C、D、E、F各組大鼠血清LN含量明顯降低(P＜0.05);與C組大鼠相比，D組大鼠血清LN含量較之升高(P＜0.05)，F(xiàn)組大鼠血清LN含量較之明顯減低(P＜0.05)，E組大鼠血清LN含量與之比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D、E、F各組大鼠之間血清LN含量相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中F組大鼠含量最低，D組大

12、鼠含量最高，E組大鼠含量居中。
　　5.各組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA、Col-Ⅳ mRNA的表達(dá)各組大鼠肝臟組織IGFBP7 mRNA的表達(dá):與A組大鼠相比，B、C、D、E、F各組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.05);與B組大鼠相比，C、D、E、F各組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)均減弱(P＜0.05);與C組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)較之減弱(P＜0.05)，D組大鼠肝

13、組織IGFBP7 mRNA表達(dá)較之增強(qiáng)(P＜0.05)，E組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)與之相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D、E、F各組間大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)最弱,D組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)最強(qiáng)，E組大鼠肝組織IGFBP7 mRNA表達(dá)居中。
　　各組大鼠肝臟組織Col-ⅣmRNA的表達(dá):與A組大鼠相比

14、，B、C、D、E、F各組大鼠肝組織Col-Ⅳ mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.05);與B組大鼠相比，C、D、E、F各組大鼠肝組織Col-Ⅳ mRNA表達(dá)均減弱(P＜0.05);與C組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠肝組織Col-Ⅳ mRNA表達(dá)較之減弱(P＜0.05)，D組大鼠肝組織Col-Ⅳ mRNA表達(dá)較之增強(qiáng)（P＜0.05），E組大鼠肝組織Col-Ⅳ mRNA表達(dá)與之相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;D、E、F各組間大鼠肝組織Col-Ⅳ m

15、RNA表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中，F(xiàn)組大鼠肝組織Col-Ⅳ mRNA表達(dá)最弱，D組大鼠肝組織Col-ⅣmRNA表達(dá)最強(qiáng)，E組大鼠肝組織Col-Ⅳ mRNA表達(dá)居中。
　　6.各組大鼠的肝組織中IGFBP7、Col-Ⅳ蛋白表達(dá)IGFBP7蛋白表達(dá):A組大鼠肝組織內(nèi)IGFBP7蛋白呈棕黃色或棕褐色弱陽性表達(dá)，與A組大鼠比較，B、C、D、E、F各組大鼠IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程度均增強(qiáng)(P＜0.05);與B組大鼠

16、相比，C、D、E、F各組大鼠IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程度均減弱（P＜0.05）;與C組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程度較之明顯減弱(P＜0.05)，D組大鼠IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程度較之增強(qiáng)(P＜0.05)，E組大鼠與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D、E、F各組大鼠之間IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程度相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）:F組大鼠IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程度最弱，D組大鼠IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程

17、度最強(qiáng)，E組大鼠IGFBP7蛋白陽性表達(dá)程度居中。
　　Col-Ⅳ蛋白表達(dá):A組大鼠肝組織內(nèi)Col-Ⅳ蛋白呈棕黃色或棕褐色弱陽性表達(dá)，與A組大鼠比較，B、C、D、E、F各組大鼠Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度均增強(qiáng)(P＜0.05);與B組大鼠相比，C、D、E、F各組大鼠Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度均減弱(P＜0.05);與C組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度較之明顯減弱(P＜0.05)，D組大鼠Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度較之增

18、強(qiáng)(P＜0.05)，E組大鼠與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D、E、F各組大鼠之間Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05):F組大鼠Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度最弱，D組大鼠Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度最強(qiáng)，E組大鼠Col-Ⅳ蛋白陽性表達(dá)程度居中。
　　結(jié)論:
　　1.中藥鱉甲煎丸可以明顯改善肝纖維化太鼠肝功能,減輕其肝纖維化的程度。
　　2.中藥鱉甲煎丸可以明顯降低肝纖維化大鼠血清LN水