新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的生物毒性、髓內降解及細菌學相關研究.pdf

1、第一部分:新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的生物毒性
　　目的：交大鎂合金系列（Jiao Da bio-magnesium series, JDBM）是上海交通大學輕合金精密成型國家工程研究中心設計開發(fā)的生物相容性好、強度和塑韌性相匹配、腐蝕行為近乎均勻的新型高性能生物醫(yī)用Mg-Nd-Zn-Zr(平衡-3-0.2-0.4 wt.%)基合金系列，分為2類，JDBM1具有高強度和中等塑性，應用于骨科；JDBM2具有高塑性和中等強度，應用于

2、血管支架。該合金體系添加了少量細胞毒性輕微的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時效析出強化和固溶強化效果，并可大幅度提高合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。Zn是人體生理需要的微量元素，微量加入可提高合金強度及塑性加工能力；微量Zr作為晶粒細化劑可提高合金的強韌性和耐蝕性，其在鎂合金中的生物相容性已經證實。JDBM的強度、柔韌性、耐蝕性能和生物相容性全面超

3、越已經在歐洲進入臨床實驗的WE43鎂合金。相比于商業(yè)性的WE43和AZ31鎂合金，JDBM具有更好的生物相容性。JDBM在體內90天時基本完好，在180天時降解少于40%。本實驗的目的，即通過研究含輕稀土Nd元素的JDBM鎂合金及單純的Nd對體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細胞株MC3T3-E1的毒性，分析JDBM鎂合金中稀土元素Nd的體外成骨細胞毒性，體內實驗部分通過研究Nd對昆明小鼠骨及周圍組織的生理病理影響，以及其在小鼠各器官組織中的分布，

4、來研究Nd的生物安全性及其動物體內分布情況。
　　方法：按標準方法用aMEM培養(yǎng)基制作Nd的浸提液，并稀釋為1/2、1/4、1/8幾個不同的濃度梯度，同時制作Ti合金、WE43鎂合金、JDBM鎂合金及CaP涂層JDBM鎂合金的浸提液，以正常培養(yǎng)組做空白對照，以Ti合金浸提液組做陰性對照，以0.64%苯酚組做陽性對照，用含10%澳洲胎牛血清的aMEM培養(yǎng)基對MC3T3-E1成骨細胞進行培養(yǎng)，觀察其不同時間的形態(tài)變化及增殖情況，并以C

5、CK8法檢測其不同時間的細胞增殖活性，以Annexin V PI雙染色流式細胞術檢測不同時間的細胞凋亡情況。將梯度量的Nd微粒加入正常培養(yǎng)的成骨細胞培養(yǎng)液中，最低量接近JDBM植入物釋放的Nd量，觀察微粒入胞情況，并制作細胞爬片，用電子目鏡接普通顯微鏡直接動態(tài)觀察細胞吞噬Nd微粒的情況，然后行HE染色觀察細胞形態(tài)變化。體內實驗部分，將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，檢測1、3、5天小鼠的血液電解質、肝腎功能變化、Nd在小鼠體內的分布

6、及局部病理切片觀察Nd微粒引起的病理變化。
　　結果：用CCK8法檢測細胞增殖活性，Nd浸提液原液組細胞毒性較大，與苯酚陽性對照組實驗結果一致，其與正常對照組、Ti合金浸提液組、JDBM浸提液組、WE43浸提液組、Nd浸提液1/4、1/8濃度組相比P<0.00001，而后幾者之間無明顯統計學差異。Nd浸提液原液及苯酚組與Nd浸提液稀釋至1/2組之間P<0.01，有明顯統計學差異。從流式細胞術檢測結果得知，隨Nd浸提液濃度及作用時間

7、的增加，成骨細胞凋亡明顯增多。微粒入胞實驗動態(tài)及靜態(tài)觀察發(fā)現，成骨細胞通過主動胞吞作用吞噬周圍環(huán)境中的Nd微粒，微粒較少時細胞生長無明顯影響，微粒量多時則可導致成骨細胞膜破裂，直至細胞崩解死亡。通過計算比較，JDBM及WE43中Nd2.5%左右的含量可能會導致周圍細胞的損傷。將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，小鼠的血液電解質及肝腎功能較正常組無明顯變化。小鼠體內各組織器官的Nd元素分布因無合適的檢測合作單位而待測，病理組織切片顯示大

8、量的Nd微粒對周圍組織細胞有一定的損傷。
　　結論：Nd浸提液的成骨細胞毒性及對成骨細胞凋亡的影響隨濃度的減小而減小，JDBM中微量Nd對成骨細胞無明顯毒性；成骨細胞通過主動胞吞作用攝取周圍環(huán)境中的Nd微粒，當微粒數量達到一定程度時，成骨細胞崩解，JDBM中微量Nd顆粒對成骨細胞的增殖及形態(tài)無明顯不良影響。相對于Nd微粒的細胞損傷，JDBM和WE43中的Nd含量可能過高。Nd微粒對小鼠的肝腎功能、電解質無明顯影響，多量的Nd微粒對

9、周圍組織細胞有一定的損傷。
　　第二部分:新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的髓內降解及病理生理效應
　　目的：生物體內可降解吸收材料是生物材料發(fā)展的重要方向，由于金屬材料具有較好的強度和塑韌性，因此金屬基可降解吸收材料具有重要的臨床應用價值。鎂是所有金屬材料中生物力學性能與人體骨最接近的金屬材料，具有理想的生物力學相容性，因此，鎂合金作為可降解生物材料具有巨大的應用潛力。目前臨床應用的生物體內可降解吸收材料主要是聚合物和某些陶瓷

10、材料，如聚乳酸、磷酸鈣等。但由于聚合物材料強度偏低、陶瓷材料的塑韌性較差限制了其廣泛使用。近年來，以生物可降解鎂合金(biodegradablemagnesium alloys)為主要代表的具有生物可降解(吸收)特性的新一代醫(yī)用金屬材料的研究受到了人們的特別關注。鎂合金因具有與人體骨頭接近的密度和彈性模量、高比強度和比剛度、生物可降解性以及生物相容性等優(yōu)點，近10年來國內外研究人員對其應用于骨內植物、骨組織工程支架和心血管支架等領域進行

11、了廣泛的研究。然而，目前大多數研究均以現有商用鎂合金為對象，如含Al元素的AZ31、AZ91以及含重稀土元素的WE43等，并未考慮到作為生物材料的安全性等問題。上海交通大學輕合金精密成型國家工程研究中心，作為我國重要的鎂合金材料及精密成型工藝研究的國家級研究基地，近年來在可降解醫(yī)用鎂合金材料研究領域也取得了令國際同行矚目的研究成果。該研究中心研究人員與醫(yī)學研究人員合作，積極開展生物醫(yī)用鎂合金材料的臨床應用基礎研究。上海交通大學研究人員運

12、用第一性原理計算與分子動力學模擬方法，并與實驗相結合，從原子、分子水平深入系統地探索了鎂的變形機制，定量評估了所優(yōu)選的生物相容性好的合金元素對鎂中層錯能及位錯滑移、孿生等變形傾向的影響，設計開發(fā)了生物相容性好、強度和塑韌性相匹配、腐蝕行為接近均勻腐蝕的新型高性能生物醫(yī)用鎂合金Mg-Nd-Zn-Zr基合金系列(Jiao Dabio-magnesium series，簡稱JDBM)，已經分別申請中國和國際專利保護。該合金體系中通過加入少量細

13、胞毒性輕微(臨床可接受)的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時效析出強化和固溶強化效果，并可大幅度提高鎂合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。JDBM可降解鎂合金自研制成功以來，一直在進行各項臨床前實驗研究，以了解其各項生物學性能，以便進一步改進其各項性能并爭取早日應用于臨床醫(yī)療實踐中。我們已經做了一些JDBM鎂合金釘板系統方面的研究，取得了許多重要的第一手

14、資料，但尚未進行JDBM鎂合金髓內針方面的實驗研究。本實驗的目的在于檢測可降解JDBM鎂合金髓內針對大鼠股骨代謝的影響及其病理生理變化，并檢測JDBM鎂合金髓內針在大鼠股骨髓腔內的降解行為，通過動物實驗研究對本材料的醫(yī)用價值做出一定程度的評估。
　　方法：將JDBM鎂合金及對照的Ti合金、WE43鎂合金、CaP涂層JDBM做成1 mm x30 mm的髓內針，消毒后進行無菌手術將其植入雄性SD大鼠左側股骨髓腔內，每組6只。在1、3個

15、月進行99mTc-MDP骨三相掃描及SPECT-CT檢查，通過骨顯像核素掃描了解大鼠股骨植入JDBM鎂合金髓內針后的代謝狀況，比較與對照側及對照組的差異。1、3個月拍攝X線片了解髓內針的位置與降解的大體情況。在15天，1、3、6個月檢測大鼠的血生化電解質變化。3、6個月做骨組織病理硬切片，通過骨硬組織切片觀察大鼠股骨的病理變化，并檢測不同時間髓內針的降解情況，確定其降解速率。
　　結果：JDBM髓內針組大鼠股骨的放射性標記物攝取率

16、明顯高于對側股骨及Ti合金對照組，P<0.01，與WE43組及CaP涂層JDBM組相比無明顯差異。骨三相掃描顯示鎂合金髓內針植入側血供旺盛。血電解質檢測各組未見明顯差異。大鼠股骨X線片攝片顯示，1、3月時JDBM髓內針形態(tài)完好，密度均勻，但6、8月時影像略顯模糊，X線透光程度不等，CaP涂層JDBM髓內針及WE43髓內針也出現程度不等的類似變化，可能系鎂合金刺激周圍骨組織增生所致。大鼠骨硬組織病理切片顯示，JDBM髓內針在大鼠髓腔內緩慢

17、降解，并促進骨組織增生，未見明顯畸形細胞。與Ti合金組相比，JDBM及CaP涂層JDBM組、WE43組髓內針周圍成骨明顯。1個月、3個月、6個月的時間內，JDBM髓內針在大鼠骨髓腔內緩慢降解，至6個月時降解不超過20%，直徑由最初的1 mm至大于0.8 mm，質量減少不超過20%，而CaP涂層JDBM組降解更為緩慢，WE43組降解略快于JDBM組，Ti合金組無降解。
　　結論： JDBM對實驗動物大鼠的血清肝腎功能、電解質無明顯影

18、響。JDBM在大鼠髓腔內4個月時降解比較輕微，刺激周圍骨組織增生的作用已經顯現，6個月時周圍骨組織明顯增生，相應的JDBM髓內針影像略顯模糊，應力遮擋效應減弱。JDBM等鎂合金髓內針可導致大鼠局部核素攝取增多，表明局部代謝旺盛，鎂合金有促進大鼠髓腔內代謝的作用。JDBM髓內針可促進骨代謝及骨形成，有利于損傷骨組織的修復。JDBM鎂合金髓內針在骨髓腔內逐漸降解，后期降解趨于緩慢。JDBM及CaP涂層JDBM、WE43髓內針植入大鼠股骨后，

19、其髓腔內組織皆未發(fā)現明顯的不良反應。
　　第三部分:新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM與葡萄球菌粘附及生物膜模型
　　目的：骨科假體植入后葡萄球菌感染是世界范圍內比較棘手的問題，醫(yī)療實踐中通過應用各種材料改性技術和研發(fā)新材料等方法以期減少感染的發(fā)生。關節(jié)假體感染（prosthetic joint infection， PJI）和無菌性松動是人工關節(jié)置換術后的重要并發(fā)癥。在美國，PJI是導致人工全膝關節(jié)置換術失敗的首要原因，也是人工