RSB66和HSD13編碼蛋白質(zhì)的功能研究.pdf

1、　　本論文應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，以全長(zhǎng)的RSB66蛋白為誘餌，篩選人睪丸cDNA文庫(kù)，共獲得2個(gè)與RSB66蛋白相互作用的分子：HSD45和HSD46。HSD45全長(zhǎng)cDNA為985bp,開(kāi)放讀碼框編碼221個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。Blast分析發(fā)現(xiàn)HSD45與一新基因完全相同。該基因因能通過(guò)與cyclinA1相互作用抑制CDK的活性，故命名為INCA1。HSD46全長(zhǎng)cDNA為1163bp。開(kāi)放讀碼框編碼317個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈?，F(xiàn)已發(fā)

2、現(xiàn)在類人猿、家犬和牛的基因組中都有該基因的同源基因存在，提示該基因在進(jìn)化上較保守。　　在進(jìn)一步的研究中，我們分別選用了體外和體內(nèi)兩種體系確證了RSB66和HSD45的相互作用。首先，利用原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)和純化了融合蛋白GST-HSD-45和His6-RSB66，將等量的純化His6-RSB66加到事先已結(jié)合GST-HSD45或GST的GlutathioneSepharose4B柱中進(jìn)行GSTpulldown實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)His6-

3、RSB66與GST-HSD45同時(shí)被洗脫下來(lái)，證明這兩種蛋白質(zhì)在體外能發(fā)生相互作用。　　為了研究RSB66和HSD45在精子發(fā)育階段的表達(dá)情況，我們制備了大鼠睪丸生精細(xì)胞涂片。用免疫熒光的方法檢測(cè)了這兩種蛋白質(zhì)在不同生精細(xì)胞中的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSB66蛋白特異性的表達(dá)于圓型精子細(xì)胞，而且熒光信號(hào)主要分布于細(xì)胞漿中。由于RSB66基因來(lái)源于我們構(gòu)建的用初級(jí)精母細(xì)胞消減圓型精子細(xì)胞的消減cDNA文庫(kù)，上述結(jié)果也證實(shí)了我們建立的消減文庫(kù)的特