肛門(mén)直腸畸形直腸末端腸神經(jīng)系統(tǒng)的改變及其與Shh-BMP4信號(hào)的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　 1、通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)及骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）在直腸末端腸壁的表達(dá)情況，研究不同類型先天性肛門(mén)直腸畸形(anorectal malformation，ARM)胎鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)的發(fā)育程度，探討ARM患兒術(shù)后排便功能障礙的機(jī)制。
　　

2、 2、通過(guò)檢測(cè)Shh/BMP4信號(hào)在直腸末端的表達(dá)水平，探索正常及ARM胎鼠ENS發(fā)育過(guò)程中可能涉及的分子調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、ARM動(dòng)物模型建立：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，應(yīng)用全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)致畸，建立ARM胎鼠模型。在實(shí)驗(yàn)組孕鼠(n=10)妊娠第10天時(shí)，將ATRA以40mg/mL濃度溶于橄欖油后，按100mg/kg一次性大劑量灌胃；對(duì)照組

3、孕鼠(n=6)給予等量橄欖油灌胃。
　　 2、NSE和BMP4的免疫組化染色：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組孕鼠，于孕20天時(shí)行剖宮術(shù)，胎仔置于4％多聚甲醛中固定過(guò)夜，以正中矢狀位劈開(kāi)胎鼠，取其盆部常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，所得標(biāo)本矢狀位連續(xù)切片，厚度為4μm，在顯微鏡下觀察未染色的石蠟切片，根據(jù)直腸閉鎖位置區(qū)分高低位，分別選取對(duì)照組、高位ARM組、低位ARM組胎鼠標(biāo)本15例，取正中矢狀位切片進(jìn)行免疫組化染色。
　　 3、RT-PCR實(shí)驗(yàn)

4、：解剖顯微鏡下剖取直腸末端組織1cm，置于液氮中暫存。分別檢測(cè)12例高位ARM組、低位ARM組、對(duì)照組直腸末端Shh和BMP4基因的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫組化染色：對(duì)照組腸壁肌間及黏膜下神經(jīng)叢可見(jiàn)NSE和BMP4抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞，ARM高位組分別與ARM低位組、對(duì)照組比較，陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(meanoptical density，MOD)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；ARM低位組和

5、對(duì)照組相比，陽(yáng)性細(xì)胞的MOD值略降低，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、半定量分析Shh、BMP4基因mRNA含量：在直腸末端Shh和BMP4基因表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01，r=0.884)，對(duì)照組分別與高、低位ARM組相比較，BMP4和Shh基因的表達(dá)水平明顯高于各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，不同畸形組之間比較，高位ARM組的表達(dá)水平顯著減弱，低于低位ARM組，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05