Mini-MFC亞基間相互作用的研究和eIF5-CTD晶體結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、Mini-MFC組裝機(jī)制的研究和eIF5-CTD晶體結(jié)構(gòu)的研究多因子復(fù)合物(MFC)是43S前起始復(fù)合物形成過程中的一個重要的中間體，它由eIF1，eIF2，eIF3和eIF5四個蛋白質(zhì)翻譯起始因子包含十幾個亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。MFC在真核生物蛋白質(zhì)翻譯起始過程中起重要作用，主要參與蛋白質(zhì)重起始過程中三元復(fù)合物(TC)的招募和AUG起始密碼子的正確識別。mini-MFC是MFC組裝的最小核心部分，包含eIF1，eIF2Bβ-NTD，

2、eIF3c-NTD和eIF5-CTD四個亞基，其中eIF5-CTD是最關(guān)鍵的亞基，它可以與其它三個亞基相互作用，從而介導(dǎo)mini-MFC的組裝。 eIF5-CTD是真核生物蛋白質(zhì)翻譯起始因子5(eIF5)的C末端。eIF5是eIF2的一種特殊的GTP酶激活蛋白(GAP)，在真核生物蛋白質(zhì)翻譯起始過程中，對前體起始復(fù)合物的組裝和AUG起始密碼子的正確識別起重要的作用。eIF5-CTD除了可以直接與eIF1，eIF2β-NTD，eI

3、F3c-NTD結(jié)合形成mini-MFC外，還可以與eIF4G相互作用，在43S和48S復(fù)合物的組裝過程中起核心作用。 本文先構(gòu)建了mini-MFC的四個亞基，通過凝膠過濾層析法，熒光共振能量轉(zhuǎn)移法和沉降速度法對四個亞基的相互作用做了研究，并嘗試計(jì)算解離常數(shù)。通過凝膠過濾層析實(shí)驗(yàn)得知elF1與elF3c-NTD，elF2β-NTD與elF5-CTD，eIF3c-NTD與eIF5-CTD可以形成二元復(fù)合物；eIF1、eIF2β-NT

4、D與eIF3c-NTD，eIF1、eIF3c-NTD與eIF5-CTD，eIF2β-NTD、eIF3c-NTD與eIF5-CTD可以形成三元復(fù)合物，eIF1、eIF2β-NTD、elF3c-NTD與elF5一CTD可以形成四元復(fù)合物。首先我們對單個亞基的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，得到了eIF5-CTD亞基的晶體并收到了1．5A的晶體數(shù)據(jù)。通過結(jié)構(gòu)分析得知eIF5-CTD含有HEAT模式，與eIF2Bε-CTD和eIF4G-CTD的結(jié)構(gòu)相似。通過

5、對表面靜電荷分布的分析和保守序列的分析確定了一些eIF5-CTD和其它eIFs的結(jié)合區(qū)域，這為理解mini-MFC的組裝機(jī)制以及復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析提供了重要的信息。鉤端螺旋體cbiC的晶體結(jié)構(gòu)的研究cbiC是維生素B12生物合成途徑中的一種異構(gòu)酶，它可以催化甲基重新排列。維生素B12是自然界中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的蛋白質(zhì)輔助因子之一，在合成過程中需要多種蛋白酶輔助完成。在原核生物和動物(包括人類)中許多酶需要維生素B12做為輔酶因子，但僅有一些

6、細(xì)菌和古菌能生物合成維生素B12。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)維生素B12的生物合成主要通過厭氧和好氧兩種途徑。這兩種途徑的主要區(qū)別在于早期類似卟啉環(huán)的形成時Co<'2+>的插入時間，最先需要Co<'2+>插入的途徑為厭氧途徑，最后需要Co<'2+>插入的途徑為好氧途徑。 本文中的cbiC是從問號狀鉤端螺旋體(一種致病細(xì)菌)的cDNA通過PCR克隆構(gòu)建到：pET22b載體上的基因，經(jīng)過Ni柱親和層析純化。純化的蛋白質(zhì)通過懸滴氣相擴(kuò)散的方法