真核細胞翻譯起始因子亞基eIF3g的核定位及相互作用核蛋白的研究.pdf

1、真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)是一類重要的細胞內功能蛋白，形成蛋白質翻譯起始復合物，引導蛋白質合成的起始。已明確的eIFs有六種(eIF1～eIF6)，每種eIF由多個亞基組成。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)一些eIFs的亞基在腫瘤細胞中存在異常表達的現(xiàn)象，并且這些亞基表達的異常與腫瘤的惡性行為相關，如eIF4E在腫瘤細胞中表達異常升高，可以作為一個有效的治療靶點，

2、因此eIFs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們的關注。eIF3是最大最復雜的一個真核翻譯起始因子，是蛋白質翻譯起始復合物中與其他翻譯起始因子相互聯(lián)系的中心蛋白因子之一。目前已知eIF3由13個亞基組成，分子量約為700～800 kD，其各亞基按分子量遞減分別命名為eIF3a至eIF3m。eIF3g是eIF3的一個核心亞基，在翻譯終止后的再起始過程中起著重要作用，并且該亞基還具有與細胞骨架蛋白4.1R和凋亡誘導因子AIF相結合的位點。

3、本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)eIF3g在耐藥的白血病細胞中高表達，下調白血病細胞中eIF3g的表達可以抑制白血病細胞的耐藥性及生長;在乳腺癌臨床標本中，eIF3g的過表達與淋巴轉移正相關。這些發(fā)現(xiàn)給我們進一步研究eIF3g在腫瘤中的機制提供了依據(jù)，我們設想在腫瘤中異常表達的eIF3g蛋白有可能通過非翻譯起始相關的機制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定的作用。
　　在本課題中，我們首先通過生物信息學手段預測了eIF3g可能具有細胞核定位，進一

4、步用實驗驗證了eIF3g的核定位，并尋找、鑒定與之相互作用的核蛋白，為今后的研究提供線索。我們通過核質分離技術結合Western blot、細胞免疫熒光染色驗證了eIF3g在細胞核中的存在，通過核蛋白免疫共沉淀結合質譜分析鑒定了與eIF3g在細胞核中相互作用的蛋白質，包括不均一核糖核蛋白（hnRNPU），鋅指蛋白(HSZFP36)，和肌動蛋白(β-actin)，并采用了正反向的免疫共沉淀、化學交聯(lián)、GST-pulldown以及激光共聚焦

5、共定位觀察等多種技術進行了多方面驗證。具體內容如下:
　　1.預測并驗證eIF3g的細胞核定位
　　通過在線生物信息學工具WoLF PSORT(http://wolfpsort.org)，PROSTⅡPrediction(http://psort.hgc.jp/form2.html), Subnuclear Compartments PredictionSystem(http://array.bioengr.uic.edu/

6、subnuclear.htm)和 PredictProtein(https://www.predictprotein.org)預測eIF3g的亞細胞定位及功能，通過核質分離后Western blot檢測和激光共聚焦觀察驗證eIF3g的亞細胞定位。四個生物信息學工具都預測了eIF3g具有細胞核定位，PredictProtein預測了eIF3g在細胞核中具有結合DNA和RNA等功能。細胞核蛋白的Western blot檢測和細胞免疫熒光染色

7、結合激光共聚焦觀察都驗證了eIF3g具有細胞核定位。
　　2.鑒定與eIF3g相互作用的核蛋白
　　為了進一步研究eIF3g在細胞核中相互作用的蛋白質，我們構建了穩(wěn)定過表達eIF3g的Bcap37/Tet-On-eIF3g細胞株，分離細胞核并裂解獲得核蛋白，以eIF3g抗體進行免疫共沉淀，SDS-PAGE電泳分離后考馬斯亮藍染色，選取共沉淀的蛋白條帶進行質譜分析鑒定。與對照相比，免疫共沉淀得到4條較明顯的蛋白條帶，質譜分析鑒

8、定分別為真核細胞翻譯起始因子3A(eIF3A)、不均一核糖核蛋白（hnRNPU）、鋅指蛋白(HSZFP36)和肌動蛋白(β-actin)，這些蛋白均通過Western blot和激光共聚焦觀察證實存在于核蛋白組分中。
　　3.驗證與eIF3g相互作用的核蛋白
　　分離Bcap37/Tet-On-eIF3g細胞核，將細胞核蛋白進行正反向免疫共沉淀，正向免疫共沉淀結果表明eIF3g抗體可沉淀出hnRNPU、HSZFP36、β-a

9、ctin，反向共沉淀結果表明hnRNPU、HSZFP36、β-actin抗體可沉淀出eIF3g。對核蛋白進行化學交聯(lián)后利用Western blot檢測，結果表明eIF3g可與hnRNP U、HSZFP36和β-actin結合成復合體。我們還構建了質核表達GST-eIF3g融合蛋白的載體，轉化細菌后誘導表達，與Bcap37細胞核蛋白及連接磁珠的GSH相互作用后進行Western blot檢測，結果表明GST-eIF3g可以下拉h(huán)nRNP

10、U、HSZFP36和β-actin。此外，對Bcap37/Tet-On-eIF3g細胞進行eIF3g的免疫熒光染色后，利用激光共聚焦顯微鏡也觀察到eIF3g與HSZFP36和β-actin的共定位。因此，免疫共沉淀、化學交聯(lián)、GST-pulldown和激光共聚焦觀察共定位都證實了eIF3g與HSZFP36和β-actin相互作用。創(chuàng)新性結論:本研究首次發(fā)現(xiàn)并證明eIF3g可以進入細胞核，并能與hnRNPU、HSZFP36、β-actin