非洲鴕鳥BAFF的克隆表達及飲水硼對其表達的影響.pdf

1、B細胞刺激因子（BAFF）是腫瘤壞死因子(TNF)家族中的主要成員之一，是具有維持B細胞功能穩(wěn)定作用的重要細胞因子。BAFF與T細胞的活化、B淋巴細胞的發(fā)育及體液免疫等直接相關(guān)。BAFF可以使尚未完全成熟的B細胞分化成更加成熟的B細胞，同時BAFF還可以延長B細胞的存活、促進抗體的產(chǎn)生，BAFF因其在B細胞發(fā)育及自身免疫病中起非常重要的作用而日益受人關(guān)注和重視。
　　非洲鴕鳥因其生長速度快，適應(yīng)性廣，飼料轉(zhuǎn)化率高，近年來其養(yǎng)殖規(guī)模

2、穩(wěn)步發(fā)展。但是在非洲鴕鳥的養(yǎng)殖過程中，3月齡以內(nèi)的雛鴕鳥對多種病原的易感性較強，非常容易發(fā)生各類疾病，給非洲鴕鳥養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
　　硼(B)是一種微量元素，廣泛分布于自然界。硼具有多種生物學作用。近年的研究表明，硼可能是某些動物生長發(fā)育和新陳代謝過程中不可或缺的微量元素。對動物的大量研究發(fā)現(xiàn)硼可以影響機體的免疫功能，生理劑量的硼具有止痛、抗炎和增強免疫等作用，較高劑量的硼具有毒性作用，可導致免疫器官發(fā)育受阻和免疫功能低

3、下。
　　本研究以非洲鴕鳥為對象，參考已有的鳥類BAFF基因序列設(shè)計引物，擴增鴕鳥BAFF基因，通過基因克隆、原核表達和熒光定量PCR等方法研究BAFF基因在各免疫器官內(nèi)的表達及其蛋白的生物學活性。同時通過在飲水中人工添加不同劑量的硼，利用實時熒光定量PCR等方法檢測分析硼對BAFF基因在非洲雛鴕鳥不同組織中表達情況的影響，為探究硼的營養(yǎng)作用和免疫毒性作用奠定基礎(chǔ)，為非洲鴕鳥的不同病原免疫防御機制的研究提供有價值的參考，同時也可為

4、非洲鴕鳥及其它鳥類的疾病防治提供科學的依據(jù)。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1、非洲鴕鳥BAFF基因的克隆與序列分析
　　參考GenBank中公布的其它禽類BAFF的基因序列設(shè)計引物，以非洲鴕鳥法氏囊總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增，成功擴增出非洲鴕鳥BAFF基因全序列。所得序列用MEGA5.05軟件和SignalP4.1 server軟件對其堿基序列和氨基酸序列進行同源性分析和進化樹分析。結(jié)果表明:非洲鴕鳥BAFF基因全長

5、867 bp，編碼288個氨基酸;同源性分析發(fā)現(xiàn)，非洲鴕鳥BAFF基因氨基酸序列與雞BAFF基因氨基酸序列的同源性最高，達52％，其次是鵪鶉(qsBAFF，51％)、鴨(dBAFF，50％)、鵝(gBAFF，50％)和鴿子(doBAFF，49％);非洲鴕鳥BAFF基因堿基序列進化樹分析顯示非洲鴕鳥BAFF基因與雞、鵪鶉的同源性最近，其次是鴨、鵝和鴿子;氨基酸序列進化樹分析結(jié)果顯示分析所用的氨基酸序列分為三支，一支包含了分析所用的所有鳥類

6、，一支包含了所用的魚類，另一支包含了所有的哺乳動物，非洲鴕鳥BAFF基因氨基酸序列與其它鳥類的同源性較近。這些結(jié)果可為鳥類BAFF基因的進化研究以及分子生物學研究提供參考。
　　2、非洲鴕鳥BAFF基因的原核表達
　　根據(jù)本研究克隆獲得的非洲鴕鳥BAFF基因序列設(shè)計特異性引物，分別在上、下游引物中加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點，成功擴增出非洲鴕鳥BAFF基因后，將該基因片段克隆至pET-28a原核表達載體;PCR、酶切鑒

7、定結(jié)果表明成功構(gòu)建了陽性重組表達質(zhì)粒pET-OsBAFF。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導表達，將表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析、Western blotting驗證，最終確定該重組蛋白大小為32.2 kD。
　　3、非洲鴕鳥BAFF基因的組織表達研究
　　采用real-time PCR方法分析了非洲鴕鳥BAFF基因在18種組織中的mRNA表達情況。結(jié)果顯示:BAFF廣泛分布于所檢測

8、的組織中，但在不同組織中的表達量有差異。非洲鴕鳥BAFF在法氏囊、胸腺、脾臟和骨髓等組織中表達量較高，其次是肝、腎臟、氣管、肺、胃和腸，在其它檢測的組織中的表達量相對較低，最低的是心臟和腦，幾乎無表達。非洲鴕鳥BAFF基因組織分布的差異提示其在不同組織中所發(fā)揮的主要功能可能有所不同。
　　4、非洲鴕鳥BAFF基因重組蛋白的生物學活性研究
　　哺乳動物和其它鳥類的BAFF是B細胞存活的重要影響因子。為驗證非洲鴕鳥的BAFF蛋白

9、是否也可以延長B細胞的存活時間。對表達獲得的非洲鴕鳥BAFF基因重組蛋白進行純化，利用MTT實驗法測定該重組蛋白在非洲鴕鳥B淋巴細胞增殖中的作用。結(jié)果顯示:添加了純化的重組蛋白或添加純化的重組蛋白和PMA的試驗組的B淋巴細胞培養(yǎng)24h時，其細胞生長情況與重組蛋白的添加濃度有明顯的相關(guān)性，當添加12μg/mL的重組蛋白或者16μg/mL的重組蛋白和2μg/mL的PMA時，B淋巴細胞生長密度達到最大值，而對照組添加PBS及BSA組，其B淋巴

10、細胞均無明顯增多。對小鼠淋巴細胞增殖的影響試驗表明，非洲鴕鳥BAFF基因重組蛋白在體外可以產(chǎn)生與非洲鴕鳥法氏囊B淋巴細胞增殖試驗類似的結(jié)果，同樣可以刺激小鼠B淋巴細胞存活/增殖。LPS刺激實驗結(jié)果表明，非洲鴕鳥BAFF基因mRNA表達水平在法氏囊淋巴細胞受LPS刺激后的6、12、24及48小時后均高于對照組。非洲鴕鳥BAFF基因mRNA表達水平自LPS刺激后6h開始大幅上調(diào)，最大值出現(xiàn)在刺激后24 h;與對照組相比，直到刺激后48 h其

11、mRNA表達一直保持在相對較高水平。
　　5、飲水硼對非洲鴕鳥BAFF基因組織表達的影響
　　為探究微量元素硼對非洲鴕鳥BAFF基因組織表達的影響，取健康1日齡非洲鴕鳥48羽，將其隨機分為6組，每組8羽。分別在飲水中添加0mg/L（對照組），40 mg/L，80 mg/L，160 mg/L，320 mg/L，640 mg/L劑量的硼酸，分別于1d，45d和90d取材，分別取法氏囊、胸腺、骨髓、脾等組織，提取總RNA作為模板，

12、采用熒光定量PCR法分析不同飲水硼組非洲鴕鳥BAFF基因的組織表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):非洲鴕鳥BAFF基因mRNA的組織表達與飲水中硼的添加劑量相關(guān)。低劑量時，所測8種組織中BAFF基因mRNA的表達隨飲水中硼添加劑量的增加而升高;當硼添加劑量到一定程度時，隨著添加劑量的增大，BAFF基因的表達反而降低。45日齡時，骨髓、脾、胸腺、肺等4種組織中BAFF基因表達的最大值為160 mg/L試驗組，法氏囊、肝、腎等3種組織中BAFF基因表達的最