陸地棉expansin-like基因GhEXLB2在棉花抗旱中的功能研究.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，是紡織原料的主要來(lái)源，具有相對(duì)較強(qiáng)的抗逆性，然而環(huán)境問(wèn)題日益突出，土地鹽堿化、水資源匱乏逐漸成為制約棉花產(chǎn)量、影響棉花品質(zhì)的重要因素。因此，培育抗旱、耐旱的棉花品種對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。Expansin是一種能促進(jìn)細(xì)胞壁膨脹的蛋白家族，包括α-expansin、β-expansin、expansin-like A和expansin-like B四個(gè)亞家族。近年來(lái)關(guān)于expansin參與植物逆境響應(yīng)的研究

2、逐漸增多，但其作用機(jī)制仍不清楚。本研究基于前期棉花原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁抑制差減文庫(kù)中分離到一個(gè)expansin-like基因GhEXLB2，對(duì)其在棉花中的抗旱功能進(jìn)行初步鑒定和機(jī)制探索，主要結(jié)果如下:
　　序列同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)GhEXLB2與可可TcEXLB1最同源，相似度為92％，并且具有expansin蛋白典型的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域;啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)GhEXLB2上游啟動(dòng)子含有較多的逆境響應(yīng)、傷口誘導(dǎo)、脫水誘導(dǎo)和激素響應(yīng)元件;逆

3、境和激素誘導(dǎo)表達(dá)分析表明GhEXLB2受PEG和NaCl等逆境因子誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明其可能參與棉花抗非生物逆境過(guò)程。
　　本研究前期已獲得GhEXLB2超量表達(dá)和RNAi干涉表達(dá)材料，通過(guò)加代獲得轉(zhuǎn)基因純系材料。我們對(duì)這些轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行萌發(fā)期、苗期和成株期干旱處理，萌發(fā)期用PEG6000滲透處理模擬干旱處理發(fā)現(xiàn)，GhEXLB2超表達(dá)系的主根長(zhǎng)和下胚軸長(zhǎng)顯著高于對(duì)照和干涉系，而H2O2含量顯著低于干涉系;幼苗期通過(guò)PEG6000處理，

4、發(fā)現(xiàn)超表達(dá)系萎蔫程度更輕，并且超表達(dá)系植株葉片中H2O2含量顯著低于對(duì)照和干涉系，而MDA含量略低于對(duì)照和干涉系;成株期通過(guò)斷水處理后，轉(zhuǎn)基因株系的萎蔫程度沒(méi)有明顯差異，但復(fù)水后，超表達(dá)系植株能更快地恢復(fù)生長(zhǎng)。因此，通過(guò)萌發(fā)期、苗期及成株期抗旱性鑒定發(fā)現(xiàn)，在棉花中超表達(dá)GhEXLB2能夠增強(qiáng)棉花的抗旱性。
　　我們對(duì)成株期干旱處理8天（土壤相對(duì)含水量在16％-19％之間）的GhEXLB2轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系的倒一葉葉片取樣進(jìn)行RN

5、A-seq測(cè)序，以正常澆水的材料作為對(duì)照。通過(guò)比對(duì)組之間的比對(duì)篩選，共篩選到316個(gè)差異表達(dá)基因，將這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因在細(xì)胞組成、生物學(xué)進(jìn)程和分子功能上主要富集在與微管和細(xì)胞骨架相關(guān)的生物進(jìn)程和功能上。處理組中tubulin基因的熱圖分析表明，大部分tubulin在超表達(dá)材料中上調(diào)表達(dá)，而在干涉材料中下調(diào)表達(dá)，表明GhEXLB2上調(diào)表達(dá)能夠增強(qiáng)大多數(shù)tubulin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。從這些差異基因中挑選出

6、表達(dá)差異極顯著的可能與抗旱相關(guān)的基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證結(jié)果基本與RNA-seq測(cè)序結(jié)果吻合，尤其是微管蛋白基因α-tubulin(Gh_D02G1393)、ACC氧化酶基因(Gh_A07G0773)和AP/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因(Gh_ D07G0442)在正常澆水情況下不同材料中的表達(dá)量無(wú)明顯差異，但在干旱處理的不同材料中，這些基因在超表達(dá)株系中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照和干涉系。同時(shí)，我們以GhEXLB2蛋白為誘餌通過(guò)酵母雙雜交篩選棉

7、花非生物逆境文庫(kù)，共篩選到19個(gè)與GhEXLB2蛋白互作的蛋白，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其中有7個(gè)能與GhEXLB2蛋白互作激活報(bào)告基因表達(dá)，包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Gh_D06G225)、WD40重復(fù)家族蛋白(Gh_A01G0493)、泛素(Gh_D01G0586)、NF-YB超家族蛋白(Gh_D13G1387)、核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(Gh_D07G2027)、E2泛素綴合酶(Gh_D11G0132)以及谷氧還蛋白(Gh_A10G0874)