骨肉瘤腫瘤血管生成與微血管密度在瘤體內(nèi)的分布差異研究.pdf

1、目的：觀察人骨肉瘤與荷人骨肉瘤皮下移植瘤瘤體內(nèi)不同區(qū)域VEGF和微血管密度(microvessel density，MVD)的分布是否存在差異，分析瘤體內(nèi)不同區(qū)域VEGF表達與MVD的關(guān)系，為臨床上骨肉瘤標本取材部位的確定以及有關(guān)骨肉瘤腫瘤血管生成的臨床與基礎(chǔ)研究提供實驗參考。 方法： 1.選取3例經(jīng)手術(shù)切除的完整的骨肉瘤標本，以腫瘤中心為原點建立空間坐標系，在垂直軸、矢狀軸、冠狀軸上以1cm為基本單位取空間坐標點。腫瘤

2、標本根據(jù)所取坐標點依次切取組織塊，所有組織塊均用10％福爾馬林液固定，石蠟包埋。應用所有石蠟包埋的組織塊制作組織芯片，芯片上每點直徑1.0mm，點間距0.5 mm。每個腫瘤制作一個芯片矩陣，矩陣中每點代表一個石蠟包埋的組織塊。組織芯片5μm厚切片，應用免疫組化技術(shù)，VEGF多克隆抗體標記VEGF，CD34單克隆抗體標記微血管，檢測芯片上每個腫瘤組織點VEGF的表達，計數(shù)MYD，計算VEGF陽性目標積分光密度。參考Ma及孟悛非等對骨與軟組

3、織腫瘤邊緣與中心區(qū)域的定義，把骨肉瘤標本所有點分為3組。取腫瘤的最大內(nèi)切圓的圓心(O)作為其中心，在病灶邊緣任意取點A～G，自O向病灶邊緣各點作放射狀連線，然后取每條線段的中內(nèi)1/3點、中外1/3點，將每條線段等分為3份。分別連接中內(nèi)l/3點、中外1/3點，形成大小不等的、與腫瘤外形相似的同心圓，將病灶分為3個部分，其中內(nèi)側(cè)部為腫瘤的內(nèi)層，外側(cè)部為腫瘤的外層，兩層之間的部分為腫瘤的中層。即將腫瘤所有點分為內(nèi)層、中層、外層3組。內(nèi)層代表腫

4、瘤的“中心區(qū)域”，外層代表腫瘤的“邊緣區(qū)域”，中層代表二者交界區(qū)。 2.建立荷骨肉瘤裸鼠動物模型：采用骨肉瘤細胞系MG-63，0.2ml細胞懸液(約1×106個細胞)/只注射到20只裸鼠腋背部皮下，一周后成瘤，二周后切取腫瘤。選取12個大小均(1.0s*1.0*1.0cm3)的移植瘤標本切取8um厚冰凍切片，應用免疫組化技術(shù)，VEGF多抗標記VEGF，CD34標記微血管，檢測VEGF表達，計數(shù)MVD。冰凍切片要求：按順序切片，標

5、記清楚；標本每隔1mm連續(xù)切取2-4張切片。每張CD34單抗、VEGF多抗標記的冰凍切片均以其中心為原點左右上下移動，每移動1mm確定為一個空間坐標點，并在顯微鏡下對該坐標點拍照計算MVD、VEGF陽性目標積分光密度，最后將一個腫瘤的所有空間坐標點還原成一個完整腫瘤標本，每個坐標點代表腫瘤的不同空間位置，對每個點進行分析時除外腫瘤壞死組織。參考等對骨與軟組織腫瘤邊緣與中心區(qū)域的定義，把移植瘤標本分為2組。以腫瘤的中心為圓心(O)，以5m

6、m為直徑的圓形區(qū)域以內(nèi)為腫瘤內(nèi)層，圓形區(qū)域以外為腫瘤外層。即將腫瘤劃分為內(nèi)層、外層2組。內(nèi)層代表腫瘤的“中心區(qū)域”，外層代表腫瘤的“邊緣區(qū)域”。上述圖像數(shù)據(jù)分析均采用MoticMed6.0圖像處理軟件，包括微血管密度計數(shù)(MVD)，VEGF表達的量化值(陽性目標積分光密度)。 結(jié)果： 1.3個人骨肉瘤標本分析結(jié)果一致，即外層與中層VEGF表達、MVD分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，內(nèi)層與外層、中層之間VEGF表達、

7、MVD分布差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。人骨肉瘤瘤體邊緣區(qū)域的VEGF表達、MVD均高于腫瘤中心區(qū)域。在骨肉瘤瘤體內(nèi)層、中層與外層VEGF表達與MVD均呈正相關(guān)，即瘤體外層、中層VEGF表達高微血管分布較多，內(nèi)層VEGF表達低微血管分布較少。 2.骨肉瘤移植瘤標本分析結(jié)果為，移植瘤外層、內(nèi)層之間VEGF表達、MVD分布差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。瘤體邊緣區(qū)域(或外周)VEGF表達及MVD均高于中心區(qū)域(或內(nèi)

8、部)。在瘤體內(nèi)層外層VEGF表達與MVD均呈正相關(guān)，即瘤體外層VEGF表達高微血管分布較多，內(nèi)層VEGF表達低微血管分布較少。 結(jié)論：人體骨肉瘤和荷人骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的瘤體內(nèi)，不同區(qū)域的VEGF表達和MVD的分布存在差異。在臨床上對骨肉瘤標本送病理時，即使腫瘤中心區(qū)域沒有壞死，也應取材腫瘤邊緣組織，以有利于腫瘤的病理學分析；在對骨肉瘤標本進行腫瘤血管生成的相關(guān)研究時，應標明取材部位，避免因瘤體內(nèi)部微血管的分布差異而引起的實驗