間充質干細胞聯(lián)合環(huán)孢霉素A對角膜移植排斥的作用研究.pdf

1、穿透性角膜移植術(penetratingkeratoplasty，PKP)的術后免疫排斥反應是導致手術失敗的最主要原因。間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有調節(jié)多種免疫細胞(包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞以及樹突狀細胞)增殖和功能的作用。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)MSCs可以延長角膜植片存活時間，在此基礎上，本研究通過大鼠異體角膜移植排斥反應動物模型，觀察不同時期尾靜脈注射MSCs，以及MSCs聯(lián)合不同

2、濃度環(huán)孢霉素A(CyclosporinA，CsA)對角膜抑制排斥反應發(fā)生和轉歸的干預情況，初步闡明MSCs的免疫調節(jié)機理，以及MSCs與CsA之間的聯(lián)合作用，為臨床治療角膜移植排斥反應提供新的思路和可供選擇的方法。
　　方法:
　　1.原代培養(yǎng)Wistar大鼠MSCs，達90％融合時傳代培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測培養(yǎng)細胞的表型，并做體外誘導分化實驗，以備后續(xù)實驗使用。
　　2.制作大鼠角膜移植動物模型，隨機分為12組。注：

3、其中(A、B、C組為重復上一階段實驗組)A組：對照組，給予等量不含藥物的PBS。B組：術前尾靜脈注射MSCs組。C組：術后尾靜脈注射MSCs組。D組：排斥發(fā)生時尾靜脈注射MSCs組。E組：術后注射MSCs+肌注1mg/kg/天CsA。F組：術后注射等量PBs+肌注lmg/kg/天CsA。G組：術后注射MSCs+肌注2mg/kg/天CsA。H組：術后注射等量PBS+肌注2mg/kg/天CsA。I組：術后注射MSCs+肌注5mg/kg/天C

4、sA。J組：術后注射等量PBs+肌注5mg/kg/天CsA。K組：術后注射MSCs+肌注10mg/kg/天CsA。L組：術后注射等量PBs+肌注10mg/kg/天CsA。裂隙燈下對角膜植片進行臨床觀察，以混濁、水腫和新生血管3項指標作為臨床評估標準，比較各組角膜植片的平均存活時間。
　　3.角膜移植模型建立后10天，收集A、C、G與H組大鼠脾臟以及腹股溝淋巴結，分離單個核細胞，在刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)刺

5、激下孵育72h后，采用BrdU試劑盒檢測各組大鼠免疫應答強度。
　　4.取ConA刺激下A、C、G與H組大鼠脾臟和淋巴結單個核細胞孵育72h后的上清液，采用ELISA試劑盒檢測Th1類和Th2類細胞因子分泌情況。
　　5.角膜移植模型建立后10天，取A組和C組大鼠脾臟以及淋巴結，流式細胞儀測定CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的百分比。
　　結果:
　　1.成功分離并鑒定了MSCs，MSCs呈間

6、質細胞特性：梭形，漩渦狀排列。VonKossa染色、油紅染色貼壁細胞呈骨樣細胞及脂肪樣細胞分化。
　　2.成功建立大鼠角膜移植動物模型。
　　3.采用MSCs單獨治療角膜移植術后大鼠，術后注射組角膜植片的存活時間與A組相比明顯延長(P<0.05)。術前和排斥時治療組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4.單獨使用CsA治療角膜移植術后大鼠，除F組，H、J和L組大鼠角膜植片存活時間均顯著延長(P<0.05

7、)。
　　5.MSCs與2mg/kg的CsA聯(lián)合治療大鼠排斥模型時(G組)，與單獨使用MSCs或2mg/kgCsA相比(C和H組)，植片存活時間延長。MSCs與5mg/kgCsA或10mg/kgCsA聯(lián)合應用時，聯(lián)合效果不顯著(P>0.05)。而MSCs與1mg/kgCsA聯(lián)合應用時，MSCs對植片的保護作用被逆轉(P<0.05)。
　　6.T細胞增殖實驗表明，MSCs和/或CsA均可以顯著抑制T細胞增殖(P<0.05)。<

8、br>　　7.ELISA結果顯示，C、G、H組Th1細胞因子分泌顯著降低(P<0.05)，而Th2細胞因子(IL-4)分泌升高(P<0.05)。與對照組(A組)相比，C組大鼠體內CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞比例顯著增高(P<0.05)。
　　結論:
　　MSCs可以通過抑制T細胞免疫應答、改變Th1/Th2應答平衡以及上調調節(jié)性T細胞，有效預防并治療角膜移植免疫排斥反應。MSCs與CsA聯(lián)合使用，其效果取決于C