液相芯片技術在中樞神經系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應用研究.pdf

1、中樞神經系統(tǒng)感染性疾病是由多種病原體（病毒、細菌、真菌、寄生蟲、朊病毒等）所引起的中樞神經系統(tǒng)常見和多發(fā)性疾病。嚴重的神經系統(tǒng)感染進展迅速，死亡率高，或留下嚴重的后遺癥。為了降低該類疾病的死亡率和提高治愈率，這時對患者腦脊液中的病原體進行早期、快速的檢測鑒定就顯得十分重要了。早期、準確的診斷可以幫助臨床醫(yī)生及時給予病人有效的藥物治療。
　　目的：目前，病原體的診斷方法主要依賴于腦脊液染色鏡檢，病原體培養(yǎng)，PCR技術等。但是，傳統(tǒng)的

2、檢測方法受多種客觀因素的影響,達不到早期、快速、準確診斷的目的。液相芯片技術具有高通量、準確、快速、靈敏、特異、可定性定量檢測等顯著優(yōu)點。在本研究中，我們基于液相芯片技術建立一種能夠早期、快速、高通量檢測多種病原體的診斷方法。方法：本實驗以腦膜炎和腦炎常見的5種病原體（結核分枝桿菌、新生隱球菌、肺炎鏈球菌、單純皰疹病毒1,2型）為研究對象。我們通過選擇5種病原體的特異性基因，從GenBank獲得保守基因序列，進行序列比對，保證其特異性。

3、應用oligo6.65設計特異性引物及寡核苷酸探針，通過生物信息學分析和試驗驗證，篩選出針對五種病原體的5對特異性引物及相應的探針。首先用5’-H2NC12標記的寡核苷酸探針包被編碼微球作為反應載體，然后將各種探針熒光微球混合，制作懸浮芯片。該技術通過探針與單重或多重PCR擴增片段的雜交反應，來驗證檢測的特異性和敏感性。最后，通過對臨床腦脊液標本的檢測，評估液相芯片技術應用于臨床檢測的可行性。結果：在實驗中，我們用設計的引物分別單重擴增

4、五種病原體核酸，PCR擴增結果提示五對引物的設計是合適的，均可以實現(xiàn)對目的基因片段的有效擴增。為了保證多重擴增的一致性和穩(wěn)定性，確定最佳反應條件，需要對多重PCR的反應條件進行優(yōu)化，最終選擇55℃為適宜的退火溫度，該溫度能夠兼容五對引物的同時擴增。液相芯片技術檢測的雜交條件優(yōu)化包括雜交溫度和雜交時間的確定，優(yōu)化后的雜交溫度為55℃，雜交時間為20min。本實驗所建立的五重檢測體系，可同時對結核分枝桿菌、新生隱球菌、肺炎鏈球菌、單純皰疹病

5、毒1,2型進行檢測。檢測結果與PCR驗證實驗結果一致，實驗證實了基于液相芯片技術的五重檢測體系是可行的。通過對結核分枝桿菌、肺炎鏈球菌和單純皰疹1型病毒的敏感度檢測，敏感度可達到fg級。其中結核分枝桿菌的檢測敏感度為224fg/μl，肺炎鏈球菌的敏感度為55fg/μl，單純皰疹1型病毒為35fg/μl。我們還利用液相芯片技術檢測了41例確診為結核性腦膜炎患者的CSF標本，檢出39例陽性，與檢測的“金標準”相比較，符合率為95.1％；結核