新型豬膠原基真皮支架細胞毒性及與細胞相容性的實驗研究.pdf

1、目的: 通過對一種新型的豬膠原基真皮支架(PCDM)的組織超微結(jié)構(gòu)進行觀察并對其細胞毒性進行檢測，為這種新型生物材料的實驗及臨床安全應用提供依據(jù)。通過將體外培養(yǎng)的人成纖維細胞種植到豬膠原基真皮支架乳頭層和網(wǎng)狀層面上，觀察人成纖維細胞在不同層面的黏附和生長特點，探討改良異種真皮替代物，提高其細胞相容性的方法。 方法: 1)通過HE、免疫組織化學染色和掃描電鏡觀察豬膠原基真皮支架的組織結(jié)構(gòu)并與異體脫細胞真皮(HADM

2、)和豬脫細胞真皮(PADM)的組織結(jié)構(gòu)相比較。 2)制取不同濃度的PCDM浸提液，設(shè)陽性對照，陰性對照與空白對照，以L-929細胞為檢測細胞。繪制不同接種濃度時本實驗室L-929細胞的標準生長曲線，確定合適的細胞接種濃度，用MTT法檢測真皮支架不同濃度的浸提液對細胞增殖的影響情況，按醫(yī)用生物材料細胞毒性分級標準進行評級。 3)應用組織塊培養(yǎng)法進行人成纖維細胞的分離和培養(yǎng)。 4)用MTT法測定種植24小時后人成纖維

3、細胞在PCDM乳頭層面的黏附情況，并與空白培養(yǎng)板對照，確定細胞在支架上的種植密度。 5)將PCDM真皮乳頭層面和真皮網(wǎng)狀層面分別朝上鋪于培養(yǎng)板上，接種人成纖維細胞，于接種后1、7、14天通過HE染色，掃描和透射電鏡觀察成纖維細胞在其不同層面上的分布增殖狀況和形態(tài)及功能狀態(tài)。 結(jié)果: 1)組織學觀察：光鏡下PCDM表皮已完全去除，真皮內(nèi)未見細胞成分、血管、毛囊和皮脂腺等皮膚附件，膠原基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)保持完整。乳頭層面

4、光滑完整，免疫組織化學染色見上有一層極薄線形的棕黃色的染區(qū)，提示基底膜完整，其下為與基底膜平行、規(guī)則排列的膠原纖維，乳頭層膠原排列相對致密；網(wǎng)狀層表面較粗糙，可見斷裂的膠原纖維的殘端，膠原束較乳頭層粗大、疏松。掃描電鏡顯示PADM和PCDM的膠原纖維排列致密有序，結(jié)構(gòu)與HADM極為類似，但豬真皮的膠原纖維較人真皮排列更為緊密，提示豬真皮內(nèi)的膠原纖維含量大于人真皮內(nèi)的膠原纖維含量。橫斷面掃描電鏡顯示：PCDM膠原束排列比PADM疏松類似于

5、HADM。 2)在接種細胞數(shù)量定為5×10<'3>/孔和1×10<'4>/孔時，一周內(nèi)L929生長曲線可以看出細胞量與代謝增殖率間呈正直線相關(guān)，細胞活力佳，測量所得數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，最適宜進行PCDM細胞毒性的測定。采用標準的細胞毒性檢測方法檢測PCDM，其細胞增殖度與空白對照及陰性對照無顯著性差異，明顯優(yōu)于陽性對照組，細胞毒級評分為0～1，可認為PCDM無明顯的細胞毒性。 3)FB在PCDM上的黏附數(shù)目明顯低于在培養(yǎng)板上的

6、黏附數(shù)，在PCDM上的黏附數(shù)目相當于在培養(yǎng)板上的50﹪。 4)HE染色顯示：FB接種于PCDMl天時，A組較B組有更多的樣本見到散在的FB的粘附，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；7天時，A組較B組有更多的樣本見單層的線形排列的FB細胞膜片，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，未見FB長入真皮基質(zhì)內(nèi)，A組和B組均有樣本見到FB呈復層生長，層與層之間細胞連接較松散，B組有6/25個樣本見細胞長入真皮基質(zhì)內(nèi)；14天時，A組有18/27

7、的樣本無FB粘附，而B組僅有9/30的樣本無細胞生長，并見更多的真皮基質(zhì)內(nèi)有FB長入，差異有統(tǒng)計學意義(P<4.01)。掃描電鏡觀察：3天時在乳頭層和網(wǎng)狀層均可見到星形的FB伸出偽足緊貼于PCDM表面，部分區(qū)域見平行排列的梭形的FB通過長長的突起連接，7天時見FB呈梭形密布于PCDM乳頭層表面，功能活躍的FB胞膜及附近有纖細的膠原原纖維交織成網(wǎng)狀。透射電鏡下見PCDM兩面上成纖維細胞功能活躍，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體豐富，高爾基復合體發(fā)

8、達，核仁明顯，核染色質(zhì)呈大小不等的顆粒狀。 結(jié)論: 1)經(jīng)過多種物理化學方法處理的這種豬膠原基真皮支架是一種無毒、安全的新型的天然異種真皮支架。 2)人成纖維細胞在豬膠原基真皮支架上增殖良好，部分樣本可見細胞遷入支架內(nèi)部，說明豬膠原基真皮支架具有較好的細胞相容性，不存在異種抗原阻礙人成纖維細胞的遷入，可能是膠原結(jié)構(gòu)方面的缺陷使細胞不能廣泛遷入，提示進一步的結(jié)構(gòu)改良有助于提高其細胞相容性。 3)在細胞種植的