去細(xì)胞化肝臟支架組織相容性及體外細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:我國(guó)是肝病大國(guó),對(duì)于終末期肝衰竭患者十分常見。然而,到目前為止,針對(duì)終末期肝病的根治性方法只有肝臟移植。受到器官短缺及長(zhǎng)期服用抗排斥藥物等不利因素,這種治療方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床上的需求,許多需要肝臟移植的病人在等待肝源的過程中死去。生物人工肝系統(tǒng)作為一種有效手段已經(jīng)用于急性肝衰竭(ALF)治療,或作為等待肝源及肝移植后恢復(fù)階段的肝臟替代治療。但是受到技術(shù)限制、生物安全性及成本較大等因素的影響,現(xiàn)有的人工肝系統(tǒng)還有待進(jìn)一步的改進(jìn)

2、?？傊?現(xiàn)有的肝臟替代治療手段都未能完全滿足臨床的需要,尋求一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效的肝臟功能替代療法已經(jīng)十分迫切,肝臟組織工程是構(gòu)建可移植肝臟的一條創(chuàng)新型途徑,其核心內(nèi)容是利用生物學(xué)和工程學(xué)的原理,通過將大量肝細(xì)胞(或肝樣細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞材料與生物支架材料相復(fù)合,構(gòu)建出一個(gè)可供移植的組織工程肝臟,用以對(duì)病損肝臟進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能上的永久性替代。因此,組織工程肝臟的研究對(duì)緩解現(xiàn)有肝臟治療措施的不足具有重大的研究意義。
　　

3、由于肝臟的組織結(jié)構(gòu)及生理功能復(fù)雜,組織工程化肝臟對(duì)于種子細(xì)胞和支架材料的要求就更為苛刻。良好的支架材料應(yīng)有足夠的表面積用于細(xì)胞粘附,也應(yīng)有足夠的空間使細(xì)胞集落擴(kuò)展,增殖,足夠的孔隙以利于物質(zhì)與氣體的交換,具有可降解性,良好的生物相容性。然而,相對(duì)于復(fù)雜的肝臟結(jié)構(gòu),以往所使用的人工合成支架材料都顯得過于簡(jiǎn)單,無法滿足肝細(xì)胞高密度生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的要求,更無法模擬肝臟組織復(fù)雜的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。因此,尋找最大限度模擬體內(nèi)肝細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的三維支

4、架材料用于肝細(xì)胞培養(yǎng),保證細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)及功能的維持,是解決組織工程化肝臟構(gòu)建的首要問題。
　　 去細(xì)胞化支架的出現(xiàn),從根本上打破了傳統(tǒng)支架材料結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的局限。去細(xì)胞化支架是指通過化學(xué)或物理的方法將細(xì)胞破壞并從組織中完全移除,完好地保留了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及組織器官的三維支架結(jié)構(gòu),早已成為組織工程研究中的熱點(diǎn)。去細(xì)胞化肝臟生物支架與以往的支架材料相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)。首先,它保留的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為肝細(xì)胞生長(zhǎng)提供了所需的微環(huán)境。去

5、細(xì)胞化肝臟支架保留了肝臟的大部分細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原,彈性纖維,蛋白聚糖等組分。這些成分不僅對(duì)于肝細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)等生物學(xué)行為過程中起到重要作用,而且能夠與周圍的細(xì)胞發(fā)生交互作用,為細(xì)胞的分化、遷移及細(xì)胞之間相互作用提供信號(hào)。第二,支架中保留的血管網(wǎng)絡(luò)解決了肝細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)輸入與廢物排出的難題,從而使肝細(xì)胞的組織化培養(yǎng)成為可能。另外,由于細(xì)胞外基質(zhì)成分在不同的物種之間具有高度保守性,所以去細(xì)胞化技術(shù)得到的細(xì)胞外基質(zhì)支架具有良好的生物

6、相容性及低免疫原性。最后,細(xì)胞外基質(zhì)中可能遺留的生物活性成分具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化的生物特性。至今,去細(xì)胞化支架已成功地應(yīng)用于心血管、輸尿管、膀胱等組織器官的研究中。由于去細(xì)胞化技術(shù)在肝臟組織工程中的應(yīng)用起步較晚,再加上肝臟結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜,利用去細(xì)胞化肝臟支架進(jìn)行可移植組織工程化肝臟的重建還很長(zhǎng)時(shí)間的探索。另一方面,去細(xì)胞化肝臟支架所構(gòu)建的組織工程化肝臟必須通過異體移植的形式發(fā)揮作用。去細(xì)胞化肝臟支架移植到受體體內(nèi),組織相容性是考察

7、支架能夠移植的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之一。如細(xì)胞成分去除不徹底則可引發(fā)嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng),炎癥反應(yīng)不僅可以導(dǎo)致組織細(xì)胞降解,同時(shí)也是組織鈣化的又一個(gè)重要原因。然而,既使去除了組織細(xì)胞表面的大部分高免疫源性物質(zhì)如組織相容性(MHC)Ⅰ和Ⅱ類蛋白,由于在去細(xì)胞化過程中可能殘留了少量的細(xì)胞碎片和脂質(zhì)成分,以及去細(xì)胞過程中引發(fā)的支架結(jié)構(gòu)的改變,因此仍然存在引發(fā)免疫排斥反應(yīng)或?qū)е轮Ъ芙Y(jié)構(gòu)鈣化的可能。至今,還未見關(guān)于去細(xì)胞化肝臟支架異體組織相容性的相關(guān)報(bào)道。因此

8、,積極探索利用去細(xì)胞肝臟支架構(gòu)建具有肝臟功能的組織工程化肝臟,同時(shí)進(jìn)行去細(xì)胞化肝臟支架組織相容性研究都具有重要的意義。
　　 本課題組在既往工作中己成功使用化學(xué)去垢劑方法制備去細(xì)胞化全肝臟支架。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化去細(xì)胞化大鼠肝臟的制作流程,使去細(xì)胞化效果更加穩(wěn)定。緊接著,我們利用去細(xì)胞化肝臟支架保留的管道結(jié)構(gòu)連接到體外的循環(huán)裝置上,并與肝臟腫瘤細(xì)胞系C3A細(xì)胞進(jìn)行體外循環(huán)共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞在流動(dòng)的狀態(tài)下與支架結(jié)構(gòu)緊密

9、地粘附,并能夠在較長(zhǎng)時(shí)間里保持一定的功能與活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:去細(xì)胞化肝臟支架保留的肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)為在其上進(jìn)行干細(xì)胞的高密度培養(yǎng)創(chuàng)造了條件,在去細(xì)胞化肝臟支架上種植肝細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞循環(huán)灌注培養(yǎng)甚至肝臟再生是現(xiàn)實(shí)可行的。另外,通過去細(xì)胞化肝臟支架組織異體皮下植入實(shí)驗(yàn)我們也可以看出:利用Trixton-100及SDS化學(xué)去垢劑制備的去細(xì)胞化肝臟支架脫細(xì)胞化效果完全,去細(xì)胞化后的肝臟支架結(jié)構(gòu)具有良好的組織相容性及低免疫源性,這說明使用去細(xì)胞化肝

10、臟支架作為支架材料適合異體移植,為進(jìn)一步構(gòu)建可供移植的組織工程化肝臟的研究提供了理論基礎(chǔ)。
　　 第一章:去細(xì)胞化肝臟支架體外循環(huán)灌注培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
　　 目的:利用去細(xì)胞全肝臟生物支架進(jìn)行體外肝細(xì)胞循環(huán)灌注培養(yǎng),并對(duì)所得到生物支架進(jìn)行功能測(cè)定及組織學(xué)觀察,為進(jìn)一步的體外肝臟組織重建奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:以SD大鼠作為研究對(duì)象,利用化學(xué)去垢劑方法制備全肝臟生物支架。首先取SD大鼠肝臟,將所得肝臟經(jīng)門靜脈插管后依次

11、灌注曲拉通X100(TritonX100),十二烷基磺酸鈉(SDS),用時(shí)約8小時(shí),并用0.01mM的磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗支架上殘留SDS210h,將支架結(jié)構(gòu)中的肝靜脈、膽管及肝動(dòng)脈以1＃絲線結(jié)扎。去細(xì)胞化肝臟支架經(jīng)過氧乙酸(0.1％)消毒后使用PBS溶液反復(fù)沖洗干凈,使用1ml注射器將5mlLO2細(xì)胞(約為2×107個(gè)/ml)經(jīng)去細(xì)胞化肝臟支架門靜脈注入支架中。再利用去細(xì)胞化肝臟支架保留的門靜脈系統(tǒng)連接到體外自制的循環(huán)培養(yǎng)裝置(

12、附帶恒溫箱、氧合器、蠕動(dòng)泵、混合氣體罐及培養(yǎng)基等)進(jìn)行體外循環(huán)培養(yǎng)10天,每2天換一次培養(yǎng)液,培養(yǎng)期間定期檢查細(xì)胞的功能狀態(tài)及循環(huán)系統(tǒng)的污染狀況。最后取出標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛脫水固定,石蠟包埋后切片行HE染色觀察組織細(xì)胞的生長(zhǎng)及分布狀況。
　　 結(jié)果:利用去細(xì)胞化肝臟支架構(gòu)建的體外循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)共進(jìn)行了11次體外循環(huán)培養(yǎng)。其中共有2次培養(yǎng)過程中放生污染,主要原因可能為在構(gòu)建體外循環(huán)裝置和培養(yǎng)換液過程中的操作不當(dāng)導(dǎo)致。其余9次培養(yǎng)過程中未

13、出現(xiàn)污染,其中最初5次培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)期間細(xì)胞生長(zhǎng)狀況較差,培養(yǎng)3天可見培養(yǎng)液中大量細(xì)胞碎片,生化功能檢測(cè)顯示肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差,經(jīng)病理切片檢測(cè)可見大部分細(xì)胞脫落,支架上殘留大量細(xì)胞殘片及少量肝細(xì)胞。分析原因可能為氧氣供給不合理,循環(huán)灌注速度過快導(dǎo)致細(xì)胞受剪切力影響受損等多種原因。后來通過逐漸地摸索和改進(jìn)循環(huán)培養(yǎng)方法,培養(yǎng)的結(jié)果有了很大的改善。
　　 結(jié)論:利用化學(xué)去垢劑法制備去細(xì)胞化全肝臟支架重復(fù)性好。體外循環(huán)灌注培養(yǎng)是利用去

14、細(xì)胞化肝臟支架構(gòu)建組織工程化肝臟的可行性方法,但還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)摸探索。
　　 第二章:去細(xì)胞化肝臟支架異體植入局部反應(yīng)試驗(yàn)
　　 目的:評(píng)價(jià)化學(xué)去垢劑法制備去細(xì)胞化肝臟支架的組織相容性,探究去細(xì)胞化肝臟支架植入異體組織后的局部反應(yīng)狀況,為進(jìn)一步利用去細(xì)胞化肝臟支架重建組織工程化肝臟并實(shí)現(xiàn)異體內(nèi)移植奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:以SD大鼠去細(xì)胞化肝臟支架作為研究對(duì)象,首先利用化學(xué)去垢劑法制備去細(xì)胞化肝臟支架并分組

15、:實(shí)驗(yàn)組參照實(shí)驗(yàn)一中的去細(xì)胞化方法制備去細(xì)胞化肝臟支架,陽(yáng)性對(duì)照組在制備過程中省略SDS灌洗過程。制成后使用使用過氧乙酸(0.1％)消毒(同方法一),徹底消毒后再使用PBS液反復(fù)沖洗10便,最后將支架浸泡在PBS溶液中并放置-20℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)前取出冰凍組織并將其分別制成直徑1cm、厚1mm左右的薄片。選取5、14、21、28、35共5個(gè)植入期,每一植入期用3只巴比西小白鼠(雌雄不限),陽(yáng)性對(duì)照組使用3只小白鼠。所有動(dòng)物采用乙醚麻醉,

16、將支架埋置于小鼠背部皮下與肌肉之間。術(shù)后通過大體觀察、組織學(xué)觀察評(píng)價(jià)支架組織炎癥情況,有無血管形成,有無纖維囊等。根據(jù)炎性反應(yīng)程度和包膜形成評(píng)級(jí)。
　　 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組去細(xì)胞化肝臟支架脫細(xì)胞完全,呈白色半透明狀,顯微鏡下未見明顯細(xì)胞成分殘余；陽(yáng)性對(duì)照組支架組織呈土黃色,鏡下可見細(xì)胞碎片殘余。皮下埋植實(shí)驗(yàn)生物學(xué)反應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果:可見陽(yáng)性對(duì)照組術(shù)后5天可見紅腫、化膿性表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間無一例死亡,切口愈合良好,無紅腫、潰爛等感染癥狀