MicroRNA-499對犬心衰合并房顫模型中心房和心室肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、第一部分:
　　背景與目的:心肌細(xì)胞的凋亡對心力衰竭（心衰）的發(fā)生和發(fā)展起重要作用。目前對于心衰時心室和心房肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)理仍不清楚。心衰形成房顫的基質(zhì)，使房顫更易誘發(fā)和維持，并進(jìn)一步加重心衰。有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-499(miR-499)能抑制缺血、缺氧時心室肌的凋亡;而心衰患者心室肌凋亡增加且miR-499顯著下調(diào)。因此，我們擬利用犬心室快速起搏心衰模型，研究microRNA-499對犬心室快速刺激致心衰合并房顫模型

2、中心房和心室肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)理。
　　方法:經(jīng)頸內(nèi)靜脈在犬右室植入起搏電極，利用起搏器以240次/min的頻率刺激心室制作犬的心衰模型，分別刺激0、24 h、1w和2w。用RT-PCR測定各個時間點心室和心房肌細(xì)胞的miR-499的表達(dá)水平，及心衰、電生理、凋亡和纖維化、氧化應(yīng)激、凋亡信號通路（p53和PDCD4）等指標(biāo)。
　　結(jié)果:心室快速起搏致心力衰竭模型，刺激時間為0、24小時、1周和2周。正常健康犬（對照組）左室舒

3、張末壓(LVDP)接近0mmHg。隨VTP時間延長，LVDP逐漸升高;VTP2周后LVDP平均值上升至23.04 mmHg，提示充血性心力衰竭，表明動物模型成功建立。隨VTP時間延長，各個時間點的心房有效不應(yīng)期（atrial effective refractory period，AERP）沒有顯著變化。
　　犬的左心房組織相對表達(dá)水平隨VTP時間延長而升高的只有miR-21，在刺激1wk時達(dá)到峰值（為對照組11.6倍）;相對表達(dá)

4、水平隨VTP時間延長而降低的是miR-499、423、328和133a，分別降至對照組的0.137(1 wk)、0.173(1 wk)、0.215(2 wk)、0.144(1 wk)。但是miR-1和miR-126的相對表達(dá)水平未檢測出。在犬的左心室組織，VTP后相對表達(dá)水平隨VTP時間延長而升高的只有miR-21，在刺激2 wk時達(dá)到峰值（為對照組3.96倍）;相對表達(dá)水平隨VTP時間延長而降低的是miR-499、423、328、13

5、3a、1，分別降低至對照組的0.472(1 wk)、0.435(24 hr)、0.485(2 wk)、0.459(24 hr)、0.381(2 wk)。miR-126的相對表達(dá)水平未檢測出。該結(jié)果提示miRNAs的表達(dá)變化，心房比心室更顯著，而且miR-499下降最為顯著，表明其在心衰合并房顫模型的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。
　　PDCD4作為miR-499的靶基因，在本實驗中隨刺激時間延長表達(dá)量升高，而且在左心房比左心室升高顯著，可能原

6、因是心房凋亡更為嚴(yán)重，提示PDCD4是miR-499調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。但p53未觀察到有明顯變化。
　　隨刺激時間延長，心房和心室的凋亡都逐漸加重，纖維化也隨之加重。心房的纖維化較心室更為嚴(yán)重，表明心房較易發(fā)生房顫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，構(gòu)成房顫發(fā)生的基質(zhì)。相應(yīng)的調(diào)節(jié)纖維化的microRNA-miR-21在心房和心室顯著升高，在心房升高更明顯。這與前人研究結(jié)果一致。
　　心力衰竭過程中，心房和心室肌的凋亡與氧化應(yīng)激有關(guān)，且隨時

7、間延長，氧化應(yīng)激程度越重。
　　結(jié)論:據(jù)此，我們認(rèn)為miR-499能抑制心衰時心肌凋亡，凋亡過程有miR-499的靶基因PDCD4參與。心衰合并房顫時，心房miR-499下調(diào)，miR-499通過調(diào)控其靶基因PDCD4，參與心房的凋亡;miR-21在心房顯著升高，參與纖維化過程。氧化應(yīng)激和纖維化在心室快速刺激致心衰模型中起重要作用。通過本課題進(jìn)一步明確了心衰及伴隨房顫時miR-499調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號通路，并為利用miR-499開發(fā)

8、防治心衰以及心衰合并房顫的藥物提供依據(jù)。
　　第二部分:
　　背景與目的:MicroRNA(miRNA，miR)近年來發(fā)現(xiàn)其在心房顫動（房顫）的病理生理機(jī)制中起重要的作用，房顫是臨床最常見的心律失常，目前已發(fā)現(xiàn)多種與房顫相關(guān)的miRNA，參與了電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)的調(diào)控。循環(huán)miRNA具有良好的穩(wěn)定性，作為疾病的臨床標(biāo)記物具有廣闊的前景，但對房顫患者循環(huán)miRNA的研究尚未見報道。本實驗擬利用microRNA芯片和mRNA芯片研

9、究持續(xù)性房顫與陣發(fā)性房顫患者循環(huán)miRNAs表達(dá)譜的改變，且進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，為進(jìn)一步探討miRNA對房顫的調(diào)控作用提供依據(jù)。
　　方法:分別收集持續(xù)性房顫、陣發(fā)性房顫患者和健康對照的全血各5例，用TRIzol法提取血清總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測，將提取的RNA進(jìn)行標(biāo)記，然后用miRCURYTM LNA microRNA芯片和mRNA芯片進(jìn)行雜交。microRNA芯片雜交結(jié)果掃描后，得到的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，找出差

10、異表達(dá)的miRNAs，并進(jìn)行聚類分析。然后進(jìn)行兩分類的差異基因篩選——TwoclassDif,對有差異的miRNAs和mRNA進(jìn)行RT-PCR驗證。
　　結(jié)果:和健康對照相比，持續(xù)性房顫患者和陣發(fā)性房顫患者血清中表達(dá)都有明顯差異的miRNA共有13個。其中表達(dá)上調(diào)的有8個:hsa-miR-3169，hsa-miR-3612, hsa-miR-634, hsa-miR-376a, hsa-miR-517b, hsa-miR-377*

11、,hsa-miR-590-3p，hsa-miR-664;表達(dá)下調(diào)的有5個:hsa-miR-1，kshv-miR-K12-5，hsa-miR-378c，hsa-miR-204，hsa-miR-27a，其中差異倍數(shù)最大的是hsa-miR-3169和hsa-miR-3612，均超過4倍，但這兩個miRNAs的功能尚未見報道。前人所報道過的房顫時改變顯著的miRNAs，如miR-517b和miR-664表達(dá)上調(diào)，miR-1表達(dá)下調(diào)，與前人研究結(jié)

12、果一致。而其他一些報道過的在心房顫動時表達(dá)水平改變顯著的miRNAs（如miR-328、miR-499），在本次實驗檢測中并未發(fā)現(xiàn)顯著的差異。
　　結(jié)論:持續(xù)性房顫與陣發(fā)性房顫患者循環(huán)miRNAs表達(dá)譜和相應(yīng)的mRNAs有顯著改變，為研究miRNAs在房顫中的作用機(jī)制，以及miRNAs作為房顫的治療靶點奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分:
　　背景與目的:脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal

13、 stem cells，ADMSCs)因其自我復(fù)制能力、多向分化與免疫調(diào)節(jié)潛能，而被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)的一個良好細(xì)胞來源?；谶@個背景，本實驗的目的是在體外研究傳統(tǒng)中藥地黃低聚糖（Rehmannia glutinosa Oligosaccharide，RGO）對人ADMSCs的增殖、H2O2誘導(dǎo)的凋亡、以及分泌血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和肝細(xì)胞生長因子(hepatocy

14、te growth factor, HGF)的影響。
　　主要方法:體外分離人ADMSCs，行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的表面標(biāo)記，繪制MTT生長曲線檢測細(xì)胞增殖情況。用ELISA試劑盒檢測VEGF和HGF的分泌。
　　結(jié)果:流式細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)人ADMSCs對CD90和CD29表達(dá)陽性，但是CD31、CD34和CD45表達(dá)陰性。實驗表明RGO不但能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，而且能減輕H2O2誘導(dǎo)的人ADMSCs的凋亡。RGO的保護(hù)作用機(jī)制可能與V