免疫調(diào)節(jié)劑CH對活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者iNKT細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究免疫調(diào)節(jié)劑CH1b、CH2b對健康人和活動期RA患者iNKT細(xì)胞體外增殖與功能的影響,對比CH1b、CH2b對兩組iNKT細(xì)胞作用的差異；并探討iNKT細(xì)胞對CH1b、CH2b可能的識別方式和細(xì)胞活化信號通路，為今后的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：①觀察免疫調(diào)節(jié)劑CH1b、CH2b體外對健康人和活動期RA患者iNKT細(xì)胞體外增殖與功能的影響。首先，收集健康人和活動期RA患者外周靜脈抗凝血并分離單個核細(xì)胞(periph

2、eral blood mononuclear,PBMC)；其次，經(jīng)α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇（α-Galcer）和IL-2體外刺激擴(kuò)增后，利用磁珠分選(MACS)技術(shù)分離擴(kuò)增后PBMC得到純化的恒定型自然殺傷細(xì)胞(iNKT細(xì)胞)；再次，分別與免疫調(diào)節(jié)劑CH1b、CH2b共孵育后，采用MTT法定量檢測各組iNKT細(xì)胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit檢測相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ/IL

3、-4的水平；RT-PCR檢測各組iNKT細(xì)胞中IFN-γmRNA與IL-4 mRNA表達(dá)水平；MTT法檢測各組iNKT細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性。
　?、谔接慽NKT細(xì)胞對CH1b、CH2b可能的識別方式和細(xì)胞活化信號通路。首先，收集健康人外周靜脈抗凝血并分離PBMC，經(jīng)α-Galcer和IL-2體外刺激擴(kuò)增后，利用MACS技術(shù)分離得到純化的iNKT細(xì)胞；其次，分別與免疫調(diào)節(jié)劑CH1b、CH2b及相應(yīng)CH的抗CD1d共孵育后，采

4、用MTT法定量檢測各組iNKT細(xì)胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit檢測相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ/IL-4的水平；RT-PCR檢測各組iNKT細(xì)胞中IFN-γmRNA與IL-4 mRNA表達(dá)水平；MTT法檢測各組iNKT細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性；再次，Western-Blot檢測CH1組、CH2b組iNKT細(xì)胞中T-bet與GATA3表達(dá)水平，明確CH刺激iNKT細(xì)胞活化

5、的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：1.兩組樣品中單獨(dú)IL-2組、CH1b組、CH2b組及空白對照組增殖均不明顯（P>0.05）。與相應(yīng)的對照組相比，IL-2+α-Galcer組增值率均明顯升高(P<0.05)。與相應(yīng)IL-2+α-Galcer組相比，健康人與活動期RA患者IL-2+CH1b組、IL-2+CH2b組iNKT細(xì)胞增值率顯著提高(P<0.05)。但RA患者各組增殖率均顯著低于健康人的相應(yīng)對照部分(P<0.05)；與相應(yīng)對照組相比，

6、α-Galcer均能顯著促進(jìn)iNKT細(xì)胞IFN-γ的分泌，CH1b、CH2b能明顯增加IL-4的分泌(P<0.05)，降低IFN-γ/IL-4(P<0.05)，而對IFN-γ分泌的影響未見顯著性差異(P>0.05)。RA病人各組細(xì)胞因子含量雖低于相應(yīng)健康人部分，但均明顯高于對照組(P<0.05)；與相應(yīng)的對照組相比，健康人與活動期RA患者iNKT細(xì)胞α-Galcer組IFN-γmRNA表達(dá)均明顯增高(P<0.05)；CH1b組和CH2b

7、組IL-4 mRNA的表達(dá)均明顯增高(P<0.05)而IFN-γmRNA表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)；CH1b、CH2b能顯著促進(jìn)健康人與活動期RA患者iNKT細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性(P<0.05)，但RA患者各組殺傷率均顯著低于健康人的相應(yīng)對照部分(P<0.05)。
　　2.抗CD1d組iNKT細(xì)胞增殖率、IL-4分泌、IL-4 mRNA表達(dá)、殺傷活性均低于相應(yīng)CH組，與對照組相比差異不明顯。提示CD1d抗體抵消了CH

8、1b、CH2b對IL-2刺激iNKT細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用、對IL-4分泌的促進(jìn)作用、對IFN-γ/IL-4的下調(diào)作用、對IL-4 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用和對iNKT細(xì)胞殺傷活性的促進(jìn)作用；與對照組相比，CH1b組和CH2b組T-bet表達(dá)差異不明顯而GATA3的表達(dá)明顯增高。
　　結(jié)論：1.CH1b、CH2b能促進(jìn)健康人與活動期RA患者經(jīng)IL-2活化的iNKT細(xì)胞體外增殖,活動期RA患者iNKT細(xì)胞存在增殖或活性低下；CH1b、CH

9、2b能刺激健康人與RA患者iNKT細(xì)胞分泌具有明顯Th2傾向的細(xì)胞因子，可能具有調(diào)節(jié)免疫紊亂和過度炎癥反應(yīng)的功效（CH2b更突出）；CH1b、 CH2b主要通過上調(diào)IL-4 mRNA的表達(dá)，影響iNKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，對調(diào)節(jié)活動期RA患者Th1/Th2失衡，抑制過度炎癥反應(yīng)具有重要意義（CH2b更為突出）；此外，CHlb、CH2b能夠顯著增強(qiáng)iNKT細(xì)胞毒活性；活動期RA患者iNKT細(xì)胞存在功能缺陷。
　　2.iNKT細(xì)胞對C