鈷鉻合金顆粒及其金屬離子Co2+，Cr3+導(dǎo)致的關(guān)節(jié)假體松動(dòng)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、隨著老齡化人群的增長(zhǎng)，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病逐年增高，而目前治療末期骨關(guān)節(jié)炎的有效手段仍是人工全關(guān)節(jié)置換術(shù)，盡管人工關(guān)節(jié)的材質(zhì)及設(shè)計(jì)一直不斷在改進(jìn)，但是假體無(wú)菌松動(dòng)仍就是人工關(guān)節(jié)假體置換術(shù)后最常見(jiàn)的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，而且發(fā)生率居高不下。目前治療假體無(wú)菌性松動(dòng)仍以假體翻修為主，但仍未從根本上解決假體松動(dòng)的問(wèn)題。
　　隨著科技的進(jìn)步，人工假體的材料與設(shè)計(jì)也在不斷更新，其植入人體后，隨著日常生活的應(yīng)用，磨損顆粒也隨之產(chǎn)生，這些顆粒主要包括鈦合金（T

2、i-6Al-4V）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)和鈷鉻合金(Co-Cr)，而且目前大量實(shí)驗(yàn)研究也已經(jīng)表明磨損顆粒在無(wú)菌性假體松動(dòng)的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，磨損顆粒被假體周?chē)?xì)胞吞噬，這些細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，隨之引起細(xì)胞因子釋放，它們會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生不同的炎癥及機(jī)體免疫反應(yīng)，然后導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能下調(diào)，破骨細(xì)胞功能活化，最終導(dǎo)致骨溶解和無(wú)菌性松動(dòng)。目前Co-Cr合金

3、因其耐磨性、耐腐蝕性及耐高溫性而廣泛應(yīng)用于假體制造，故而本課題將鈷鉻合金（Co-Cr）納入實(shí)驗(yàn)研究。而且一旦假體植入體內(nèi)，由于體液的作用，假體周?chē)鷮⒊霈F(xiàn)各種離子形式，對(duì)于Co-Cr合金來(lái)說(shuō)，其離子形式大多以Co2+，Cr3+形式存在。所以我們將Co-Cr顆粒及其離子形式一并研究，觀察它們的異同。
　　由于骨量是骨丟失和骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)維持的，來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞系的破骨細(xì)胞具有促進(jìn)骨吸收減少骨量的作用，而來(lái)自骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的成

4、骨細(xì)胞增加骨沉積而增加骨量。某些炎癥性細(xì)胞因子導(dǎo)致破骨細(xì)胞活化而促使骨溶解。調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的兩種重要因子分別是細(xì)胞核因子-κB受體活化因子(RANK)和細(xì)胞核因子-κB受體活化因子培基(RANKL)。RANK是RANKL的生物信號(hào)膜受體，屬于TNF受體超家族成員，在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、成熟破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)，RANK同時(shí)出現(xiàn)在單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞，RANKL-RANK鏈可以啟動(dòng)破骨細(xì)胞形成和成熟破骨細(xì)胞功能的活化。目前OPG/R

5、ANKL也公認(rèn)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟的重要條件。
　　為了研究磨損顆粒及其相對(duì)應(yīng)離子形式的骨溶解機(jī)理，探明成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化、功能活化的分子學(xué)基礎(chǔ)。人們建立了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，目前用于研究的?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、假體植入動(dòng)物模型等，但是體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷贸龅慕Y(jié)論只能簡(jiǎn)介用來(lái)說(shuō)明體內(nèi)的過(guò)程，動(dòng)物模型中常用兔、狗、羊及馬等大型動(dòng)物但是缺點(diǎn)是不易于飼養(yǎng)管理，研究費(fèi)用高，樣本含量受到限制，尤其不適合新型治療策略的研究，進(jìn)而限制了這些動(dòng)物模

6、型的廣泛使用。小鼠與人類具有基因同源性，利于進(jìn)行生物學(xué)研究等優(yōu)點(diǎn)，成為研究假體松動(dòng)模型的新的選擇。Dr.Wooley實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)小鼠的氣囊模型用來(lái)研究不同顆粒的細(xì)胞反應(yīng)和骨溶解效果，但是其缺點(diǎn)不能作為長(zhǎng)期的體內(nèi)研究。為了更接近體內(nèi)假體磨損顆粒環(huán)境，需要設(shè)計(jì)一理想的模型。我們?cè)O(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)將建立模型并應(yīng)用動(dòng)物模型研究假體周?chē)蓜?dòng)骨溶解的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　在本次研究中，我們?cè)隗w外研究首先探討Co-Cr合金及其對(duì)應(yīng)的離子形式在不同濃度下對(duì)

7、成骨前體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化成熟、參與炎性反應(yīng)及破骨細(xì)胞調(diào)控等所產(chǎn)生的不同影響，最后構(gòu)建小鼠膝關(guān)節(jié)假體置換后無(wú)菌性松動(dòng)的模型，通過(guò)該模型來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證顆粒及其離子形式刺激的成骨細(xì)胞前體細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的重要調(diào)控作用。成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1（CRL-2594）購(gòu)買(mǎi)于American type culture collection(ATCC)公司，置于α-DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)液中含5％胎牛血清的，2 mM左旋谷酰胺，1mM丙

8、酮酸鈉，100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素，37℃，5％ CO2溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)出一定數(shù)量后，加入10mM磷酸甘油，50μg/ml抗壞血酸和100 nM地塞米松誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，通過(guò)堿性磷酸酶(ALP)染色來(lái)確定成骨細(xì)胞的有效分化。將誘導(dǎo)后的細(xì)胞分別與多種濃度的鈷鉻合金顆粒（0.15，0.3，0.625，1.25，2.5和5mg/mL）及其離子形式Co2+、Cr”(62，125，250，500，1000μ M)

9、共同培養(yǎng)。并收集上清液，在顆粒及其離子形式刺激后72小時(shí)通過(guò)MTT來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增值反應(yīng)。同時(shí)分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶LDH的活性來(lái)反應(yīng)不同濃度的鈷鉻合金顆粒及其離子的細(xì)胞毒性。再測(cè)定裂解的細(xì)胞液中ALP蛋白濃度，并進(jìn)行細(xì)胞的免疫化學(xué)ALP染色以便檢測(cè)向成骨細(xì)胞分化的程度。RT-PCR測(cè)定細(xì)胞MCP-1，TNF-α，IL-6，RANKL，OPG，Runx2, LRP-5，0sx和NFATc1的基因表達(dá)。在體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)部分，通過(guò)鈦釘

10、植入脛骨近端，模仿膝關(guān)節(jié)置換術(shù)和假體周?chē)鷥?nèi)注射鈷鉻合金顆粒構(gòu)建小鼠無(wú)菌性假體松動(dòng)的模型，在術(shù)后將其分為四組:(1)顆粒實(shí)驗(yàn)組:在脛骨近端假體周?chē)⑸?0μl鈷鉻合金顆粒懸浮液(4×104)，一周后向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50μl含有5×105 MC3T3-E1的培養(yǎng)液，這些細(xì)胞是與鈷鉻合金顆粒(2.5mg/ml)共培養(yǎng)的(n=12);(2)離子實(shí)驗(yàn)組:在脛骨近端假體周?chē)⑸?0μl鈷鉻合金顆粒懸浮液(4×104)，一周后向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50μl含有

11、5×105 MC3T3-E1的培養(yǎng)液，這些細(xì)胞是與Co2+(500μM)共培養(yǎng)的(n=12);(3)假體松動(dòng)對(duì)照組:在脛骨近端假體周?chē)⑸?0μl鈷鉻合金顆粒懸浮液(4×104)，一周后向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50μl含有5×105未受顆粒及離子刺激的MC3T3 E1細(xì)胞的培養(yǎng)液(n=6);(4)無(wú)假體松動(dòng)的穩(wěn)定組:僅僅只做鈦釘植入手術(shù)，不注射鈷鉻合金顆粒和MC3T3-E1細(xì)胞。鈦釘植入完畢后立即使用MicroCT進(jìn)行假體周?chē)敲芏葴y(cè)定，到5周后

12、，處死老鼠之前一天，再次行假體周?chē)敲芏葴y(cè)定。術(shù)后5周將所有老鼠處死，并離斷患側(cè)膝關(guān)節(jié)，將小腿進(jìn)行拔釘實(shí)驗(yàn)，通過(guò)拔釘?shù)牧α看笮?lái)驗(yàn)證假體松動(dòng)的程度。拔釘后的組織立即投入固定液中固定，固定完畢后做石蠟病理切片，首先進(jìn)行假體與骨界面之間膜的厚度測(cè)定，以此反應(yīng)炎癥反應(yīng)的輕重。然后將組織切片進(jìn)行TRAP染色，以便觀察確定假體周?chē)M織中破骨細(xì)胞數(shù)量及分化成熟怙況。其他組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色TNF-α，RANKL和Runx2。
　　體外

13、實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)胞增殖及分化的過(guò)程中，單純成骨誘導(dǎo)液及添加了Cr(Ⅲ)的兩組細(xì)胞表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的多邊形，而添加了Co(Ⅱ)組細(xì)胞表現(xiàn)出伸出更多的觸角，細(xì)胞局部表現(xiàn)出透亮區(qū)，Co-Cr顆粒組細(xì)胞表現(xiàn)出長(zhǎng)梭形，吞噬的顆粒集中于細(xì)胞中央。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)鈷鉻合金顆粒及其離子形式均不同程度抑制細(xì)胞的增殖。鈷鉻合金顆粒濃度大于2.5mg/mL及其離子1，000μ M表現(xiàn)明顯的毒性作用。對(duì)于ALP蛋白及染色檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)組除Cr(Ⅲ)均表現(xiàn)出不同程度

14、的抑制，濃度越高抑制越明顯。對(duì)于PCR，鈷鉻合金顆粒組顯著促進(jìn)MCP-1、TNF-α、IL-6基因表達(dá)，然而Co(Ⅱ)組RANKL和NFATc1基因明顯表達(dá)升高，而OPG和0sx基因則被抑制表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了小鼠膝關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)模型，顆粒組(Co-Cr)和離子組(Co(Ⅱ))拔釘力量均小于假體松動(dòng)對(duì)照組和無(wú)假體松動(dòng)的穩(wěn)定組，而假體周?chē)纬傻哪ぞ裼谶@兩對(duì)照組，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的TRAP+的細(xì)胞數(shù)量均高于無(wú)假體松動(dòng)的穩(wěn)定組，而假體

15、周?chē)墙M織密度測(cè)定中，兩實(shí)驗(yàn)組均明顯小于另兩對(duì)照組。
　　總之，MC3T3-E1細(xì)胞即成骨前體細(xì)胞對(duì)Co-Cr磨損顆粒及其離子形式在各個(gè)方面均表現(xiàn)出不完全相同的生物學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖、毒性、成骨及炎癥反應(yīng)等。在本次實(shí)驗(yàn)研究中，Co-Cr磨損顆粒及其離子形式，均對(duì)成骨前體細(xì)胞的成骨分化表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且Co-Cr磨損顆粒及Co(Ⅱ)離子刺激的成骨前體細(xì)胞都會(huì)促進(jìn)多種炎性因子及相關(guān)因子的基因表達(dá)，從而進(jìn)一步參與假體周

16、圍炎性反應(yīng)和骨溶解最終導(dǎo)致假體松動(dòng)。更重要的是，Co(Ⅱ)離子刺激的成骨前體細(xì)胞高表達(dá)RANKL基因及抑制OPG基因表達(dá)，從而大大增加RANKL/OPG比值，而這一比值正是目前公認(rèn)的調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化及成熟的重要因子。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)室對(duì)假體周?chē)腡RAP+細(xì)胞的計(jì)數(shù)也證實(shí)了這一點(diǎn)。在其他方面，Co-Cr磨損顆?？梢悦黠@促進(jìn)成骨前體細(xì)胞炎癥相關(guān)的基因表達(dá)像MCP-1、TNF-α及IL-6，來(lái)共同參與假體周?chē)难装Y反應(yīng)，以至于最后造成假體松動(dòng)。所以