大鼠心肌缺血再灌注損傷心室重構(gòu)及芒果苷對(duì)其作用和機(jī)制的研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　 心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌組織恢復(fù)血流灌注時(shí)，再灌注區(qū)心肌細(xì)胞及局部血管網(wǎng)發(fā)生顯著的病理生理變化，這些變化可導(dǎo)致進(jìn)一步的心肌損傷。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的冠脈狹窄或閉塞，特別是心肌梗死是臨床引起死亡的主要疾病之一。隨著動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓療法等手段的應(yīng)用使得缺血心臟能在短時(shí)間內(nèi)重新恢復(fù)血液灌注及氧供應(yīng)，有效改善缺血心肌

2、損傷，但再灌注也可能引起心肌損傷，出現(xiàn)心律失常、梗死面積擴(kuò)大、持久性心室收縮功能低下并因此發(fā)生相應(yīng)的心室重構(gòu)，導(dǎo)致嚴(yán)重的心力衰竭。如何逆轉(zhuǎn)或減輕心肌缺血再灌注損傷及其心室重構(gòu)，對(duì)于臨床上提高缺血性心臟病的治療效果，改善心梗患者預(yù)后具有重要的意義。
　　 芒果苷(mangiferin)廣泛存在于百合科植物知母，漆樹科芒果葉中，是一種四羥基吡酮的碳糖苷，屬雙苯吡酮類黃酮類化合物。芒果苷除了能止咳、抗氧化、保肝利膽等作用，隨著研究的不

3、斷深入，其在治療糖尿病、心肌病、抗腫瘤、抗艾滋病等方面也有明顯的作用。現(xiàn)有研究表明芒果苷能清除急性心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生的一氧化氮和活性氧，降低心肌乳酸脫氫酶和磷酸肌酸激酶含量，保護(hù)心肌缺血再灌注損傷，但對(duì)MIRI心室重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)將研究大鼠心肌MIRI損傷及心室重構(gòu)的特征，探討芒果苷對(duì)MIRI損傷及心室重構(gòu)的保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討，可望為臨床上心肌梗死后患者心臟功能的恢復(fù)提供一種

4、新的輔助治療途徑。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法:
　　 第一章大鼠心肌缺血再灌注模型的建立及評(píng)價(jià)
　　 選取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，氣管切開，呼吸機(jī)支持呼吸，開胸，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)30min，松解后再灌注120min，建立大鼠心肌MIRI模型。實(shí)驗(yàn)分為2組：假手術(shù)(Sham)組及缺血再灌注(MIRI)組。Sham組大鼠只穿線，不結(jié)扎LAD。觀察其心電圖改變，記錄左心室收縮壓(LVSP)

5、，左心室舒張期末壓(LVEDP)，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。檢測(cè)心肌酶譜門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)及乳酸脫氫酶(LDH)變化；測(cè)定炎性介質(zhì)IL-6、IL-10、前列環(huán)素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)含量；檢測(cè)心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的表達(dá)水平；通過2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，計(jì)

6、算心肌梗死面積；電鏡觀察MIRI心肌超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 第二章大鼠心肌缺血再灌注損傷心室重構(gòu)的研究
　　 按前述方法建大鼠心肌MIRI模型，存活大鼠喂養(yǎng)4w，實(shí)驗(yàn)分為2組：Sham組和MIRI組。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)室間隔舒張末期厚度(IVSTd)、室間隔收縮末期厚度(IVSTs)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWd)、左室后壁收縮末期厚度(LVPWs)；左心室

7、收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)及左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)；采用Masson染色，測(cè)定心肌膠原纖維含量(CVF)；通過Tunel染色對(duì)心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析，測(cè)定細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)；通過熒光定量PCR及Western-blot技術(shù)從基因和蛋白層面分析Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)水平。
　　 第三章芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI損傷及心室重構(gòu)作用的研究
　　 實(shí)驗(yàn)一不同劑量芒果苷對(duì)大鼠

8、心肌MIRI損傷作用的研究
　　 按前述方法建大鼠心肌MIRI模型，選取不同劑量的芒果苷對(duì)心肌MIRI進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為4組：MIRI組、芒果苷低、中、高劑量組。MIRI組結(jié)扎LAD10min給予1ml生理鹽水舌下靜脈注射，芒果苷組則分別按低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(20mg/kg)劑量舌下靜脈注射干預(yù)。分別測(cè)量各組心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；檢測(cè)心肌酶譜AST、CPK、LDH變化；測(cè)定炎性介質(zhì)IL-6、IL-10、P

9、GI2、TXA2含量；檢測(cè)心肌組織中SOD、MPO、MDA、GSH-Px的表達(dá)水平；觀察電鏡對(duì)MIRI心肌超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 實(shí)驗(yàn)二芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI心室重構(gòu)作用的研究
　　 按前述方法建大鼠心肌MIRI模型，存活大鼠喂養(yǎng)4w，實(shí)驗(yàn)分為3組：MIRI組、芒果苷組、雷米普利組。MIRI組術(shù)后灌胃植物油，2ml/日；芒果苷組則根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)一結(jié)果，按20mg/kg濃度芒果苷灌胃，1次/日；雷米普利組灌胃雷米普利，0.1

10、mg/kg/日。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)LVIDd、LVIDs、IVSTd、IVSTS、LVPWd、LVPWs、LVSP、LVEDP、FS、EF。采用Masson染色，測(cè)定心肌膠原纖維含量(CVF)；通過Tunel染色對(duì)心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析，測(cè)定細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)；測(cè)定通過熒光定量PCR及Western-blot技術(shù)從基因和蛋白層面分析Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)水平。
　　 第四章芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI損傷及心室重構(gòu)保護(hù)作用

11、的機(jī)制研究
　　 按前述方法建大鼠心肌MIRI模型，存活大鼠喂養(yǎng)4w，實(shí)驗(yàn)分為4組：Sham組、MIRI組、芒果苷組、SB203580組。Sham組、MIRI組灌胃植物油2ml/日，芒果苷組灌胃芒果苷20mg/kg/日，SB203580組灌胃MAPK抑制劑SB2035802mg/kg/日。ELISA法測(cè)量血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)濃度；蛋白免疫印跡法測(cè)量心肌組織中p-P38和t-P38蛋白表達(dá)量。
　　 3.結(jié)果:

12、
　　 第一章大鼠心肌MIRI模型的建立及評(píng)價(jià)
　　 結(jié)扎LAD后成功建立了心肌缺血再灌注模型，結(jié)扎后2-5 min內(nèi)MIRI組心電圖可見QRS波寬增大，心電圖J點(diǎn)或ST段抬高與高聳的T波融合，呈弓背向上單向曲線。與Sham組比較，MIRI組收縮舒張功能下降，表現(xiàn)為L(zhǎng)VSP、±dp/dtmax均降低(P<0.05)；LVEDP升高(P<0.05)。MIRI組血清AST(871.43±69.54)、CPK(1652.86±

13、101.37)及LDH(2109.86±115.45)活性均較Sham組(555.75±55.74，1078.38±102.14，1328.13±86.99)增加(P<0.05)；心肌組織中MDA含量均較Sham組增加(P<0.05)、而SOD、GSH-Px活性均較Sham組降低(P<0.05)；血清IL-6、TXA2含量均較Sham組增加(P<0.05)，而IL-10及PGI2濃度均較Sham組降低(P<0.05)；MIRI組心肌梗死

14、面積(MIS)為(49.83±7.25％)，Sham組為0％，兩組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.05)；MIRI組超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，肌節(jié)結(jié)構(gòu)排列紊亂，肌絲溶解、斷裂、消失；線粒體增多、腫脹、嵴斷裂；核基質(zhì)空化，染色質(zhì)濃縮、形成大小和形狀不一的塊狀及碎片。
　　 第二章大鼠心肌MIRI心室重構(gòu)的研究
　　 心肌缺血30min，存活大鼠喂養(yǎng)4w后，MIRI組LVIDs明顯擴(kuò)大、LVEDP明顯升高(P<0.05)，而IVSTd、

15、IVSTs、LVPWd、LVPWs、EF、FS、LVSP等各指標(biāo)都明顯降低(P<0.05)；MIRI組心肌間質(zhì)中膠原纖維嚴(yán)重增生，CVF值(9.43±0.9％)較Sham組(3.09±0.45)升高明顯(P<0.05)；同樣，MIRI組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(33.25±4.08％)較Sham組(8.73±1.02％)有明顯上升(P<0.05)，其Caspase-3 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平(7.43±1.05)和蛋白表達(dá)水平(55.88±4.4

16、5％)均較Sham組明顯上升(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平(0.14±0.03)和蛋白表達(dá)水平(13.25±2.38)均較Sham組明顯下降(P<0.05)。
　　 第三章芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI損傷及心室重構(gòu)的作用研究
　　 實(shí)驗(yàn)一不同劑量芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI的作用研究
　　 芒果苷中、高劑量組改善MIRI大鼠心臟功能，表現(xiàn)為芒果苷中、高劑量組LVSP、±dp/dtmax較MIRI組升

17、高(P<0.05)，而LVEDP降低(P<0.05)；而上述兩組心肌酶譜分別為AST(729.38±56.43，642.63±47.09)、CPK(1417.38±89.83，1270.50±86.37)、LDH(1758.50±115.61，1553.88±91.66)均較MIRI組(871.43±69.54，1652.86±101.37，2109.86±115.45)明顯降低(P<0.05)；和MIRI組相比，芒果苷中、高劑量組IL

18、-6、TXA2表達(dá)濃度均降低(P<0.05)，IL-10、PGI2濃度均升高(P<0.05)；SOD、GPx增高(P<0.05)，MDA、MPO的表達(dá)降低(P<0.05)；芒果苷中、高劑量組心肌梗死面積分別為(29.25±2.38，24.38±2.20)，與MIRI組(38.14±3.02)比較，顯著降低(P<0.05)，同時(shí)，芒果苷中、高劑量組心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷較輕。而芒果苷低劑量組與MIRI組相比，上述指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，心肌超微結(jié)構(gòu)

19、損傷相似。
　　 實(shí)驗(yàn)二芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI心室重構(gòu)作用的研究
　　 芒果苷及雷米普利組較MIRI組顯著降低LVIDs、LVEDP(P<0.05)，而IVSTd、IVSTs、LVPWd、LVPWs、LVSP、EF、FS等指標(biāo)明顯升高(P<0.05)；芒果苷及雷米普利組可顯著減少M(fèi)IRI心肌細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(22.45±3.07％，16.48±2.32％)，較MIRI組(33.25±4.08％)下降(P<0.

20、05)；芒果苷及雷米普利組可顯著減輕心肌間質(zhì)纖維化程度，其CVF值分別為(6.49±0.81％，4.99±0.54％)，較MIRI組(9.43±0.90％)明顯降低(P<0.05)；芒果苷及雷米普利組Caspase-3 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平分別為(3.97±0.53，2.17±0.39)，蛋白表達(dá)水平分別為(33.88±3.14％，21.13±2.85％)較MIRI組(7.43±1.05，55.88±4.45％)明顯降低(P<0.05)

21、；芒果苷及雷米普利組Bcl-2 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平分別為(0.27±0.04，0.49±0.09)和蛋白表達(dá)水平分別為(24.38±2.56％，35.38±3.07％)較MIRI組(0.14±0.03，13.25±2.38％)明顯升高(P<0.05)。與芒果苷組比較，雷米普利組心臟超聲LVIDs、LVEDP顯著降低(P<0.05)，而IVSTd、IVSTs、LVPWd、LVPWs、LVSP、EF、FS等指標(biāo)明顯升高(P<0.05)；雷

22、米普利組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及心肌膠原含量較芒果苷組均明顯下降(P<0.05)；Caspase-3 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；Bcl-2 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平較芒果苷組明顯升高(P<0.05)。
　　 第四章芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI及心室重構(gòu)保護(hù)作用機(jī)制的研究
　　 MIRI組、芒果苷組心肌組織中p-P38蛋白磷酸化水平分別為(34.12±4.53％，26.17±3.47％)較

23、Sham組(19.32±2.18％)明顯升高(P<0.05)，SB203580組p-P38蛋白表達(dá)水平(21.93±2.57％)與Sham組無明顯差異(P>0.05)；與MIRI組比較，芒果苷組和SB203580組p-P38蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與芒果苷組比較，SB203580組p-P38蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。
　　 MIRI組、芒果苷組、SB203580組血清TNF-α濃度分別為(92.86±9

24、.53 ng/ml，73.63±6.65 ng/ml，54.38±4.57 ng/ml)較Sham組(20.00±濃度2.14 ng/ml)明顯增加(P<0.05)；與MIRI組比較，芒果苷組和SB203580組血清TNF-α明顯下降(P<0.05)；與芒果苷組比較，SB203580組血清TNF-α含量明顯降低(P<0.05)。
　　 4.結(jié)論:
　　 本文通過超聲、病理學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)，多層次探討了大鼠心肌MIRI損

25、傷及心室重構(gòu)的表現(xiàn)，通過不同劑量芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI的保護(hù)作用，并通過對(duì)P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，對(duì)芒果苷的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，結(jié)果提示：
　　 (1)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)30min，松解后再灌注120min，可成功建立大鼠心肌MIRI模型。氣管切開插管人工呼吸支持，可提高該模型成功率，易重復(fù)。
　　 (2)大鼠心肌MIRI損傷后心室發(fā)生重構(gòu)，表現(xiàn)為心室腔擴(kuò)大，梗死壁變薄；心肌間質(zhì)膠原纖維異常沉積，

26、心肌纖維化明顯；心肌細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，同時(shí)，促凋亡基因Caspase-3基因和蛋白表達(dá)增高，而抗凋亡基因Bcl-2基因和蛋白表達(dá)下降，提示這兩種基因失衡在MIRI導(dǎo)致的心室重構(gòu)進(jìn)程中扮演重要的角色。
　　 (3)通過不同劑量芒果苷的干預(yù)研究，首次證實(shí)芒果苷對(duì)大鼠心肌MIRI損傷有保護(hù)作用，其作用有量效關(guān)系。中、高劑量的芒果苷能有效降低血清中心肌酶譜的表達(dá)，發(fā)揮其抗炎、抗氧化作用，減輕心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷。
　　 (4)芒果