慢性低氧性肺高壓大鼠STIM-Orai-TRPC-NFATc信號(hào)通路變化及人參皂苷Rb1的作用.pdf

1、肺高壓（pulmonary hypertension，PH）的特點(diǎn)是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）靜息胞漿游離Ca2+濃度（intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i）增高、血管收縮增強(qiáng)和血管重塑。近來(lái)研究表明經(jīng)典瞬時(shí)感受器電位（canonical transient receptor potential

2、，TRPC）蛋白、間質(zhì)相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）和Orai是鈣池操縱性鈣內(nèi)流（sotre-operated calcium entry，SOCE）激活機(jī)制中的重要分子，活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NAFTc）與細(xì)胞增殖有關(guān)，在慢性低氧性肺高壓（chronic hypoxia-induced pulmonary hyper

3、tension，CHPH）和野百合堿（monocrotaline，MCT）致PH大鼠中TRPC介導(dǎo)的SOCE增強(qiáng)。本研究進(jìn)一步在CHPH大鼠模型基礎(chǔ)上，觀察STIM-Orai/TRPC-NFATc信號(hào)通路在CHPH發(fā)病過(guò)程中的作用；采用NFATc間接抑制劑環(huán)孢素（cyclosporin A，CsA）預(yù)處理，觀察其對(duì)CHPH大鼠的影響，以進(jìn)一步明確STIM-Orai/TRPC-NFATc信號(hào)通路的作用；并觀察人參皂苷 Rb1（Ginsen

4、oside Rb1，Rb1）對(duì) CHPH大鼠肺動(dòng)脈（pulmonary arteries，PAs）SOCE的作用，以期為PH治療提供新的靶向藥物。
　　第一部分 CHPH大鼠肺動(dòng)脈STIM-Orai/TRPC-NFATc信號(hào)通路的變化
　　目的：觀察STIM-Orai/TRPC-NFATc信號(hào)通路在CHPH大鼠發(fā)病過(guò)程中的作用，及其病理生理學(xué)意義。
　　方法：在SD大鼠常壓慢性低氧（chronic hypoxia，CH

5、）21 d建立CHPH大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用：①血流動(dòng)力學(xué)和PAs形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，測(cè)定大鼠右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）、右心重量指數(shù)（right ventricular mass index，RVMI）和PAs形態(tài)的變化；②熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)方法，測(cè)定大鼠PAs STIM-Orai/TRPC-NFATc mRNA表達(dá)水平，及表達(dá)上調(diào)m

6、RNA的時(shí)間曲線；③血管環(huán)張力檢測(cè)方法，測(cè)定釓離子（gadolinium，Gd3+）舒張內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）收縮大鼠 PAs效應(yīng)，及環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）誘導(dǎo)大鼠PAs收縮效應(yīng)；④Mn2+淬滅Fura-2熒光和Fluo-3熒光檢測(cè)[Ca2+]i方法，測(cè)定CPA誘導(dǎo)大鼠PASMCs胞膜Ca2+內(nèi)流速率和[Ca2+]i升高的作用；⑤MTT法，測(cè)定大鼠PASMCs的增殖情況；⑥時(shí)

7、間曲線和線性相關(guān)分析方法，觀察表達(dá)上調(diào)mRNA之間的相關(guān)性，以及與CPA誘導(dǎo)PAs收縮效和RVSP之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，①CHPH模型大鼠的RVSP和RVMI均顯著增高，肺內(nèi)小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，提示CHPH大鼠模型成功建立；②CHPH大鼠PAs STIM2-Orai2-TRPC1/6-NFATc2/3 mRNA和STIM2-Orai2-TRPC1/6蛋白表達(dá)明顯增高，提示CHPH的STIM2-Orai2

8、-TRPC1/6-NFATc2/3表達(dá)上調(diào)；③CHPH大鼠的ET-1收縮PAs效應(yīng)顯著增高，且Gd3+對(duì)ET-1收縮PAs效應(yīng)的舒張作用也顯著增大，提示CHPH大鼠PAs的高ET-1反應(yīng)性和SOCE功能增強(qiáng)；④CHPH大鼠的CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)顯著增高，進(jìn)一步提示CHPH大鼠PAs SOCE功能增強(qiáng)；⑤CHPH大鼠 PASMCs的靜息[Ca2+]i、CPA誘導(dǎo)胞膜 Ca2+內(nèi)流速率和[Ca2+]i升高幅度均顯著增高，提示CHPH大鼠

9、PASMCs SOCE功能增強(qiáng)，且其可能是引起靜息[Ca2+]i增高的重要因素；⑥CHPH大鼠PASMCs的增殖活性增強(qiáng)，提示CHPH大鼠PASMCs NFATc介導(dǎo)的功能增強(qiáng)；⑦Orai2-TRPC1-NFATc3表達(dá)上調(diào)和CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)均先于RVSP的升高，且Orai2-TRPC1和CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)與其它因素均具有很強(qiáng)的相關(guān)性，提示Orai2/TRPC1及其介導(dǎo)的SOCE功能增強(qiáng)可能是該信號(hào)通路的核心環(huán)節(jié)和啟動(dòng)因素

10、。
　　結(jié)論：CH可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生 PH；其機(jī)制可能是 CHPH大鼠的STIM2-Orai2-TRPC1-NFATc2/3表達(dá)上調(diào)，引起 STIM2-Orai2/TRPC1所介導(dǎo)的SOCE功能增強(qiáng)和NFATc2/3介導(dǎo)的PASMCs增殖活性增強(qiáng)，導(dǎo)致[Ca2+]i增高、PAs血管收縮增強(qiáng)、PAs對(duì) ET-1的高反應(yīng)性、血管平滑肌增殖和血管重塑；并且Orai2/TRPC1及其介導(dǎo)的SOCE功能增強(qiáng)可能是CHPH致病過(guò)程中的核心環(huán)節(jié)和啟

11、動(dòng)因素。
　　第二部分環(huán)孢素A干預(yù)對(duì)CHPH大鼠肺動(dòng)脈STIM-Orai/TRPC-NFATc信號(hào)通路的作用
　　目的：觀察 CsA預(yù)處理對(duì) CHPH大鼠的影響，以進(jìn)一步明確STIM-Orai/TRPC-NFATc信號(hào)通路在大鼠CHPH發(fā)病過(guò)程中的作用
　　方法：在1.25％CsA隔天腹腔注射25 mg/kg干預(yù)CHPH大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用：①血流動(dòng)力學(xué)和PAs形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，測(cè)定大鼠RVSP、RVMI和PAs形態(tài)的

12、變化；②熒光定量PCR檢測(cè)方法，測(cè)定大鼠PAs STIM-Orai/TRPC-NFATc mRNA表達(dá)水平的變化；③血管環(huán)張力檢測(cè)方法，測(cè)定Gd3+舒張ET-1收縮大鼠PAs效應(yīng)，及 CPA誘導(dǎo)大鼠 PAs收縮效應(yīng)的變化；④Mn2+淬滅 Fura-2熒光和Fluo-3熒光檢測(cè)[Ca2+]i方法，測(cè)定CPA誘導(dǎo)大鼠PASMCs胞膜Ca2+內(nèi)流速率和[Ca2+]i升高作用的變化；⑤MTT法，測(cè)定大鼠PASMCs增殖情況的變化；⑥時(shí)間曲線分析

13、方法，RVSP和RVMI變化的時(shí)間關(guān)系。
　　結(jié)果：與CH組相比，①CsA干預(yù)大鼠的RVSP和RVMI顯著降低，肺內(nèi)小動(dòng)脈管壁變薄，管腔增大，提示CsA干預(yù)能抑制CHPH大鼠模型；②CsA干預(yù)大鼠PAs Orai2-TRPC1-NFATc2/3 mRNA表達(dá)顯著減小，但對(duì)STIM2 mRNA表達(dá)無(wú)影響，提示 CsA干預(yù)抑制 CHPH大鼠 Orai2-TRPC1-NFATc2/3表達(dá)上調(diào)；③CsA干預(yù)大鼠的ET-1收縮PAs效應(yīng)顯著

14、減小，且Gd3+對(duì)ET-1收縮PAs效應(yīng)的舒張作用也顯著減小，提示CsA干預(yù)抑制CHPH大鼠PAs的高ET-1反應(yīng)性和SOCE功能增強(qiáng)；④CsA干預(yù)大鼠的CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)顯著減小，進(jìn)一步提示CsA干預(yù)抑制CHPH大鼠Pas的SOCE功能增強(qiáng)；⑤CsA干預(yù)顯著下降CHPH大鼠PASMCs靜息[Ca2+]i、CPA誘導(dǎo)胞膜Ca2+內(nèi)流速率和[Ca2+]i升高幅度，提示CsA干預(yù)抑制CHPH大鼠PASMCs的SOCE功能增強(qiáng)，且其可能

15、是靜息[Ca2+]i下降的重要因素；⑥CsA干預(yù)大鼠PASMCs的增殖活性減弱，提示CsA干預(yù)抑制CHPH大鼠PASMCs NFATc介導(dǎo)的功能增強(qiáng)；⑦CsA干預(yù)無(wú)法抑制RVSP初期的升高，但可使RVSP后期的升高幅度顯著下降及RVSP最高值提前，并可抑制RVMI的增加，提示在CHPH致病過(guò)程中血管收縮增強(qiáng)可能起著啟動(dòng)作用，而血管增殖和重塑可能起著鞏固和加強(qiáng)作用。
　　結(jié)論：CsA干預(yù)能抑制CHPH大鼠模型；其機(jī)制可能是CsA干預(yù)

16、下調(diào)CHPH 大鼠Orai2-TRPC1-NFATc2/3的表達(dá)，抑制Orai2/TRPC1介導(dǎo)的SOCE功能增強(qiáng)和NFATc2/3介導(dǎo)的PASMCs增殖活性增強(qiáng)，導(dǎo)致靜息[Ca2+]i下降、PAs血管收縮減弱、PAs對(duì)ET-1的反應(yīng)性減輕、血管平滑肌增殖減弱和血管重塑減輕。血管收縮增強(qiáng)在 CHPH致病過(guò)程中可能起著啟動(dòng)作用，而血管增殖和重塑可能起著鞏固和加強(qiáng)作用。
　　第三部分人參皂苷Rb1對(duì)CHPH大鼠肺動(dòng)脈SOCE

17、的作用
　　目的：觀察Rb1對(duì)正常大鼠和CHPH大鼠 PAs的血管效應(yīng)和機(jī)制，為PH治療提供新的靶向藥物。
　　方法：在CHPH大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用PAs血管環(huán)張力檢測(cè)、Mn2+淬滅Fura-2熒光和Fluo-3熒光檢測(cè)[Ca2+]i方法，觀察：①Rb1對(duì)正常大鼠PAs的血管效應(yīng)；②Rb1對(duì)ET-1誘導(dǎo)正常大鼠和CHPH大鼠PAs收縮的作用；③Rb1對(duì)CPA誘導(dǎo)正常大鼠和CHPH大鼠PAs收縮的作用；④Rb1對(duì)CPA誘導(dǎo)正

18、常大鼠和CHPH大鼠PASMCs胞膜Ca2+內(nèi)流速率的影響；⑤Rb1對(duì)CPA誘導(dǎo)正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs[Ca2+]i升高的影響。
　　結(jié)果：①Rb1對(duì)KCl、ET-1和Nif預(yù)處理ET-1收縮正常大鼠PAs效應(yīng)均具有濃度依賴性舒張作用，且對(duì)ET-1收縮的舒張作用最顯著，提示Rb1對(duì)正常大鼠 PAs收縮效應(yīng)的舒張作用主要通過(guò)阻斷非電壓依賴性 Ca2+內(nèi)流產(chǎn)生的事；②Rb1預(yù)處理可抑制 ET-1對(duì)正常大鼠和CHPH大鼠 P

19、As的收縮效應(yīng)，且可抑制CHPH大鼠PAs對(duì)ET-1的高反應(yīng)性，從另一方面支持其作用機(jī)制主要通過(guò)阻斷非電壓依賴性Ca2+內(nèi)流；③Rb1對(duì)ET-1預(yù)收縮正常大鼠和CHPH大鼠PAs效應(yīng)具有顯著舒張作用，且對(duì)CHPH大鼠PAs的作用更強(qiáng)，但在Gd3+舒張ET-1預(yù)收縮后無(wú)進(jìn)一步明顯的舒張作用，提示Rb1主要是通過(guò)抑制SOCE，發(fā)揮其對(duì)大鼠PAs收縮環(huán)效應(yīng)的舒張作用；④Rb1預(yù)處理可顯著抑制 CPA誘導(dǎo)正常大鼠和CHPH大鼠PAs的收縮效應(yīng)，

20、且對(duì)CHPH大鼠PAs的抑制作用更強(qiáng)，進(jìn)一步提示Rb1可通過(guò)抑制SOCE抑制大鼠PAs的收縮效應(yīng)，且也抑制CHPH大鼠PAs SOCE功能增強(qiáng)；⑤Rb1對(duì)CPA誘導(dǎo)預(yù)收縮正常大鼠和CHPH大鼠PAs效應(yīng)也具有顯著舒張作用，從另一方面支持Rb1通過(guò)抑制SOCE舒張大鼠PAs的收縮效應(yīng)；⑥Rb1可抑制CPA誘導(dǎo)正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs胞膜Ca2+內(nèi)流速率和[Ca2+]i升高的作用，提示Rb1可抑制大鼠PASMCs的SOCE功能。<

21、br>　　結(jié)論：Rb1通過(guò)抑制SOCE，發(fā)揮其抑制和舒張大鼠PAs血管的收縮效應(yīng)，并且可抑制CHPH大鼠PAs的SOCE功能增強(qiáng)。
　　綜上所述，STIM-Orai/TRPC-NFATc信號(hào)通路在CHPH致病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。CH通過(guò)上調(diào) STIM2-Orai2-TRPC1-NFATc2/3表達(dá)，介導(dǎo) SOCE功能和PASMCs增殖活性增強(qiáng)，導(dǎo)致靜息[Ca2+]i增高、PAs血管收縮增強(qiáng)、血管平滑肌增殖和血管重塑，誘發(fā)PH。Cs