小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和炎癥信號(hào)通路的影響.pdf

1、慢性低度炎癥狀態(tài)是肥胖和2型糖尿病存在重要的發(fā)病機(jī)制之一，即在肥胖2型糖尿病患者血清中多種脂肪細(xì)胞炎癥因子和炎癥標(biāo)志物分泌和表達(dá)明顯升高，如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、Ⅰ型纖溶酶原激活抑制因和抵抗素等。這些炎癥因子可以引發(fā)胰島素抵抗，還可以使胰島β細(xì)胞受損壞。它們?cè)谡{(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、血管生物學(xué)及肥胖及治療相關(guān)疾病如2型糖尿病、肥胖癥、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用?？寡滓蜃又?lián)素可以激活A(yù)M

2、PK通路，提高胰島素敏感性。因此，對(duì)抗脂肪組織的炎癥狀態(tài)或提高抗炎因子有助于改善胰島素抵抗和2型糖尿病的治療。
　　清熱藥黃連和補(bǔ)氣藥人參是中醫(yī)臨床治療2型糖尿病的常用藥材，二者配伍使用，可降低糖尿病大鼠的血糖和胰島素水平，同時(shí)降低血清游離脂肪酸，保護(hù)胰島β細(xì)胞形態(tài)和功能，顯示明顯改善胰島素抵抗的作用。小檗堿和人參皂苷分別是黃連和人參中主要的有效成分。雖然兩味中藥性味有所不同，功效迥異，但兩種化合物對(duì)機(jī)體糖脂代謝均具有顯著的調(diào)節(jié)作

3、用。
　　在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)脂肪細(xì)胞和肥胖小鼠的炎癥因子和炎癥通路具有明顯的抑制作用，但人參皂苷Rb1以及其與小檗堿合用對(duì)脂肪細(xì)胞炎癥因子分泌和炎癥信號(hào)通路的影響并不清楚。
　　目的:
　　1)探討小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞因子TNF-a、IL-6、MCP-1及Resisitin和抗炎因子脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平的影響。
　　2)探尋小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥

4、信號(hào)通路中IKK-β、JNK蛋白的表達(dá)和IKK-β(ser181)、JNK磷酸化水平的影響。
　　3)觀察小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞中蛋白NF-κB(p65)向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位的影響。更好的為小檗堿和人參皂苷Rb1在防治2型糖尿病及其相關(guān)疾病方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及臨床運(yùn)用指導(dǎo)。
　　方法:
　　第一部分小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和分泌的影響
　　采取Trizol法抽提

5、總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)、抵抗素(Resistin)、脂聯(lián)素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表達(dá)。3）分別給藥正常鼠和小鼠糖尿病自發(fā)突變純合子，14天后，禁食10小時(shí)，測(cè)量空腹血糖和血清胰島素,用戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉。收集組織和血清樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)TNF-α、脂聯(lián)素含量。
　　第二部分小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂

6、肪細(xì)胞炎癥信號(hào)通路信號(hào)蛋白作用的影響
　　采用蛋白免疫印跡(westem blotting)法檢測(cè)小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IKK-β、JNK蛋白的表達(dá)和IKK-β(ser181)、JNK磷酸化水平的作用。
　　第三部分小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB(p65)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響
　　采用免疫熒光標(biāo)記法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞N

7、F-κB p65蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和分泌的影響
　　1)小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
　　小檗堿組中小檗堿處理24 h后，脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-6、Resistin、MCP-1mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較顯著降低（P＜0.01），但脂聯(lián)素的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化;人參皂苷Rb1組人參皂苷Rb1

8、僅上調(diào)了脂聯(lián)素的表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)TNF-α、IL-6、Resistin、MCP-1的表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響;兩藥合用后，與對(duì)照組比較，TNF-α、IL-6、Resistin、MCP-1以及脂聯(lián)素的表達(dá)均無(wú)顯著變化，作為陽(yáng)性藥物的Rsg明顯地下調(diào)各炎癥因子的表達(dá)（P＜0.01），上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)水平（P＜0.01）。
　　2)小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)TNF-α刺激下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響
　　在10μmol/L TNF

9、-α刺激下所測(cè)炎癥因子的表達(dá)顯著上升，脂聯(lián)素的表達(dá)水平下降(P＜0.01)。小檗堿能夠顯著地抑制TNF-α刺激下上調(diào)的TNF-α、IL-6、Resistin和MCP-1的表達(dá)水平（P＜0.01），下調(diào)的脂聯(lián)素表達(dá)也得到部分恢復(fù)(P＜0.05);而Rb1僅抑制了TNF-α、MCP-1的表達(dá)(P＜0.01)，同時(shí)部分恢復(fù)脂聯(lián)素的表達(dá)（P＜0.05），但對(duì)IL-6、Resistin的表達(dá)未見(jiàn)顯著的影響;Ber+Rb1與單用Rb1類(lèi)似，僅降低了

10、TNF-α、MCP-1的表達(dá)(P＜0.01)，對(duì)IL-6、Resistin的表達(dá)下調(diào)未見(jiàn)顯著性，同時(shí)對(duì)脂聯(lián)素的表達(dá)也未見(jiàn)影響。
　　3)小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)小鼠體內(nèi)胰島素和因子的影響
　　在禁食10小時(shí)后，測(cè)量的空腹血糖和空腹胰島素，其中Ber組和Rb1+Ber組有顯著性差異(P＜0.01)。與正常鼠相比，db/db老鼠在給藥14天之后，Ber組和Ber+Rb1組小鼠攝食量和體重減少，附睪和肝臟的比重也明顯降低，顯著

11、降低了空腹血糖和血清胰島素，也能夠顯著地恢復(fù)了Adiponectin mRNA的表達(dá)（P＜0.01）;而Rb1組人參皂苷Rb1處理后，降低了TNF-α mRNA的表達(dá)，同時(shí)也部分恢復(fù)Adiponectin mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。
　　第二部分小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥信號(hào)通路信號(hào)蛋白作用的比較
　　在TNF-α刺激下，脂肪細(xì)胞的JNK和IKK-β的磷酸化激活明顯增加，分別給與藥物作用后，小檗堿

12、對(duì)于激活的JNK和IKK-β有明顯的抑制作用，作用與Rsg相當(dāng);而人參皂苷Rb1未見(jiàn)明顯抑制作用。兩藥合用IKK-β、JNK的磷酸化水平也未見(jiàn)明顯變化。
　　第三部分小檗堿和人參皂苷Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB(p65)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響
　　在TNF-α刺激24小時(shí)后，3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB(p65)蛋白有細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位明顯增加，分別給與藥物作用后，用10umol/L的小檗堿干預(yù)24小時(shí)能明

13、顯抑制NF-κB(p65)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，10umol/L人參皂苷Rb1以及兩藥合用對(duì)NF-κB(p65)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位沒(méi)有明顯的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1)在體外小檗堿在基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)均能下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-6、Resistin和MCP-1mRNA的表達(dá)，也能恢復(fù)TNF-α刺激后的脂聯(lián)素的表達(dá);在體內(nèi)小檗堿可以減少糖尿病模型小鼠攝食量和體重，附睪和肝臟的比重也明顯降低，顯著降低了空腹血糖

14、和血清胰島素。同時(shí)明顯抑制炎癥信號(hào)通路中IKK-β、JNK的磷酸化的活化和NF-κB(p65)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位。說(shuō)明小檗堿可能是通過(guò)IKK/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮了調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)和分泌的效果。
　　2)人參皂苷Rb1上調(diào)了脂聯(lián)素的表達(dá)，對(duì)于炎癥因子刺激的TNF-α、MCP-1的表達(dá)有一定的抑制作用，但對(duì)炎癥信號(hào)通路中IKK-β、JNK的磷酸化的活化和NF-κB(p65)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位無(wú)明顯影響。說(shuō)明其可能通過(guò)與小檗堿不