小檗堿和人參皂苷Rb1合用對脂肪細胞炎癥因子表達和炎癥信號通路的影響.pdf

1、慢性低度炎癥狀態(tài)是肥胖和2型糖尿病存在重要的發(fā)病機制之一，即在肥胖2型糖尿病患者血清中多種脂肪細胞炎癥因子和炎癥標志物分泌和表達明顯升高，如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子、單核細胞趨化蛋白-1、Ⅰ型纖溶酶原激活抑制因和抵抗素等。這些炎癥因子可以引發(fā)胰島素抵抗，還可以使胰島β細胞受損壞。它們在調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、血管生物學及肥胖及治療相關(guān)疾病如2型糖尿病、肥胖癥、高血壓、動脈粥樣硬化、心血管疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用?？寡滓蜃又?lián)素可以激活AM

2、PK通路，提高胰島素敏感性。因此，對抗脂肪組織的炎癥狀態(tài)或提高抗炎因子有助于改善胰島素抵抗和2型糖尿病的治療。
　　清熱藥黃連和補氣藥人參是中醫(yī)臨床治療2型糖尿病的常用藥材，二者配伍使用，可降低糖尿病大鼠的血糖和胰島素水平，同時降低血清游離脂肪酸，保護胰島β細胞形態(tài)和功能，顯示明顯改善胰島素抵抗的作用。小檗堿和人參皂苷分別是黃連和人參中主要的有效成分。雖然兩味中藥性味有所不同，功效迥異，但兩種化合物對機體糖脂代謝均具有顯著的調(diào)節(jié)作

3、用。
　　在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)小檗堿對脂肪細胞和肥胖小鼠的炎癥因子和炎癥通路具有明顯的抑制作用，但人參皂苷Rb1以及其與小檗堿合用對脂肪細胞炎癥因子分泌和炎癥信號通路的影響并不清楚。
　　目的:
　　1)探討小檗堿和人參皂苷Rb1合用對3T3-L1脂肪細胞因子TNF-a、IL-6、MCP-1及Resisitin和抗炎因子脂聯(lián)素mRNA表達水平的影響。
　　2)探尋小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂肪細胞炎癥

4、信號通路中IKK-β、JNK蛋白的表達和IKK-β(ser181)、JNK磷酸化水平的影響。
　　3)觀察小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂肪細胞中蛋白NF-κB(p65)向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位的影響。更好的為小檗堿和人參皂苷Rb1在防治2型糖尿病及其相關(guān)疾病方面提供實驗依據(jù)及臨床運用指導。
　　方法:
　　第一部分小檗堿和人參皂苷Rb1合用對3T3-L1脂肪細胞炎癥因子表達和分泌的影響
　　采取Trizol法抽提

5、總RNA，采用實時定量PCR檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)、抵抗素(Resistin)、脂聯(lián)素、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表達。3）分別給藥正常鼠和小鼠糖尿病自發(fā)突變純合子，14天后，禁食10小時，測量空腹血糖和血清胰島素,用戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉。收集組織和血清樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測TNF-α、脂聯(lián)素含量。
　　第二部分小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂

6、肪細胞炎癥信號通路信號蛋白作用的影響
　　采用蛋白免疫印跡(westem blotting)法檢測小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂肪細胞IKK-β、JNK蛋白的表達和IKK-β(ser181)、JNK磷酸化水平的作用。
　　第三部分小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂肪細胞NF-κB(p65)蛋白向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響
　　采用免疫熒光標記法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂肪細胞N

7、F-κB p65蛋白向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分小檗堿和人參皂苷Rb1合用對3T3-L1脂肪細胞炎癥因子表達和分泌的影響
　　1)小檗堿和人參皂苷Rb1對基礎狀態(tài)下脂肪細胞炎癥因子表達的影響
　　小檗堿組中小檗堿處理24 h后，脂肪細胞TNF-α、IL-6、Resistin、MCP-1mRNA的表達與對照組比較顯著降低（P＜0.01），但脂聯(lián)素的表達未見明顯變化;人參皂苷Rb1組人參皂苷Rb1

8、僅上調(diào)了脂聯(lián)素的表達(P＜0.05)，對TNF-α、IL-6、Resistin、MCP-1的表達未產(chǎn)生顯著影響;兩藥合用后，與對照組比較，TNF-α、IL-6、Resistin、MCP-1以及脂聯(lián)素的表達均無顯著變化，作為陽性藥物的Rsg明顯地下調(diào)各炎癥因子的表達（P＜0.01），上調(diào)脂聯(lián)素的表達水平（P＜0.01）。
　　2)小檗堿和人參皂苷Rb1對TNF-α刺激下脂肪細胞炎癥因子表達的影響
　　在10μmol/L TNF

9、-α刺激下所測炎癥因子的表達顯著上升，脂聯(lián)素的表達水平下降(P＜0.01)。小檗堿能夠顯著地抑制TNF-α刺激下上調(diào)的TNF-α、IL-6、Resistin和MCP-1的表達水平（P＜0.01），下調(diào)的脂聯(lián)素表達也得到部分恢復(P＜0.05);而Rb1僅抑制了TNF-α、MCP-1的表達(P＜0.01)，同時部分恢復脂聯(lián)素的表達（P＜0.05），但對IL-6、Resistin的表達未見顯著的影響;Ber+Rb1與單用Rb1類似，僅降低了

10、TNF-α、MCP-1的表達(P＜0.01)，對IL-6、Resistin的表達下調(diào)未見顯著性，同時對脂聯(lián)素的表達也未見影響。
　　3)小檗堿和人參皂苷Rb1合用對小鼠體內(nèi)胰島素和因子的影響
　　在禁食10小時后，測量的空腹血糖和空腹胰島素，其中Ber組和Rb1+Ber組有顯著性差異(P＜0.01)。與正常鼠相比，db/db老鼠在給藥14天之后，Ber組和Ber+Rb1組小鼠攝食量和體重減少，附睪和肝臟的比重也明顯降低，顯著

11、降低了空腹血糖和血清胰島素，也能夠顯著地恢復了Adiponectin mRNA的表達（P＜0.01）;而Rb1組人參皂苷Rb1處理后，降低了TNF-α mRNA的表達，同時也部分恢復Adiponectin mRNA的表達（P＜0.05）。
　　第二部分小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂肪細胞炎癥信號通路信號蛋白作用的比較
　　在TNF-α刺激下，脂肪細胞的JNK和IKK-β的磷酸化激活明顯增加，分別給與藥物作用后，小檗堿

12、對于激活的JNK和IKK-β有明顯的抑制作用，作用與Rsg相當;而人參皂苷Rb1未見明顯抑制作用。兩藥合用IKK-β、JNK的磷酸化水平也未見明顯變化。
　　第三部分小檗堿和人參皂苷Rb1對3T3-L1脂肪細胞NF-κB(p65)蛋白向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響
　　在TNF-α刺激24小時后，3T3-L1脂肪細胞NF-κB(p65)蛋白有細胞質(zhì)向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位明顯增加，分別給與藥物作用后，用10umol/L的小檗堿干預24小時能明

13、顯抑制NF-κB(p65)蛋白向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，10umol/L人參皂苷Rb1以及兩藥合用對NF-κB(p65)蛋白向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位沒有明顯的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1)在體外小檗堿在基礎狀態(tài)和胰島素抵抗狀態(tài)均能下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-6、Resistin和MCP-1mRNA的表達，也能恢復TNF-α刺激后的脂聯(lián)素的表達;在體內(nèi)小檗堿可以減少糖尿病模型小鼠攝食量和體重，附睪和肝臟的比重也明顯降低，顯著降低了空腹血糖

14、和血清胰島素。同時明顯抑制炎癥信號通路中IKK-β、JNK的磷酸化的活化和NF-κB(p65)蛋白向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位。說明小檗堿可能是通過IKK/NF-κB信號通路發(fā)揮了調(diào)節(jié)炎癥因子表達和分泌的效果。
　　2)人參皂苷Rb1上調(diào)了脂聯(lián)素的表達，對于炎癥因子刺激的TNF-α、MCP-1的表達有一定的抑制作用，但對炎癥信號通路中IKK-β、JNK的磷酸化的活化和NF-κB(p65)蛋白向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位無明顯影響。說明其可能通過與小檗堿不