人參總皂苷和小檗堿對腫瘤主動性免疫逃逸機制的影響.pdf

1、免疫逃逸在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用，其機制復雜，涉及腫瘤和宿主兩方面。從腫瘤角度來說，一方面，腫瘤抗原的缺失、MHC分子的改變、共刺激分子的缺乏等可以使腫瘤免受宿主免疫細胞的識別，從而逃脫抗腫瘤免疫反應；另一方面，腫瘤也可以通過"Fas反擊機制"、免疫抑制性分子的分泌等機制主動影響抗腫瘤免疫細胞的增殖活化或功能。人參總皂苷(Gs)、小檗堿(Ber)分別是補益藥人參和清熱解毒藥黃連等的組分，抗腫瘤作用明顯。Gs和Ber的抗腫瘤

2、作用機制主要是抑制增殖、誘導凋亡，抑制侵襲和轉移，誘導分化等方面，在腫瘤免疫逃逸機制方面的研究尚未見報道。本研究觀察了Gs和Ber對人肺癌PG細胞抑制Jurkat T淋巴細胞增殖和促進其凋亡的影響，以及對PG細胞FasL、Fas分子的表達及其TGF-β1、PGE2分泌的作用，以探討Gs和Ber對腫瘤細胞主動性免疫逃逸機制的影響，為Gs和Ber的抗腫瘤作用機制擴展新的研究內容，并為藥物的合理運用提供實驗依據(jù)。 本研究運用人參總皂苷

3、和小檗堿處理肺癌PG細胞24h后進行實驗，分組如下：Control組(PG細胞未經(jīng)藥物處理)，Gs組(PG細胞經(jīng)100μg/ml人參總皂苷處理)和Ber組(PG細胞經(jīng)10μg/ml小檗堿處理)。 1.首先建立PG細胞與JurkatT細胞的共培養(yǎng)體系，觀察JurkatT細胞的生長狀況和增殖情況。 (1)倒置顯微鏡下直接觀察到，Jurkat T細胞在單獨培養(yǎng)情況下成團生長，而Jurkat T細胞與PG細胞共培養(yǎng)24h后呈散在

4、生長；Jurkat T細胞與Gs組和Ber組PG細胞共培養(yǎng)后數(shù)目均較Control組明顯減少。 (2)臺盼蘭拒染實驗結果顯示，共培養(yǎng)6h、24h后，Jurkat T細胞活細胞數(shù)目明顯減少，與單獨培養(yǎng)組(Jurkat T組)有統(tǒng)計學差異；而Jurkat T細胞與Gs組PG細胞共培養(yǎng)6h、24h后其生長抑制均較Control組明顯，Jurkat T細胞與Ber組PG細胞共培養(yǎng)24h后其生長抑制也與Control組有統(tǒng)計學差異；

5、 (3)PG細胞培養(yǎng)上清液與Jurkat T細胞孵育實驗結果表明，各組PG細胞培養(yǎng)上清液與T細胞懸液(細胞數(shù)不變)的體積比為2：1、1.1、0.5：1時，Jurkat T細胞的生長均受到抑制，大部分組與陰性對照組(Jurkat T組)比較有統(tǒng)計學差異，且呈體積依賴性；各不同體積比組中，Gs組、Ber組與Control組比較均無差異。結果提示，PG細胞對Jurkat T細胞的生長有抑制作用，此作用在人參總皂苷和小檗堿處理PG細胞后更為顯

6、著。 2.分別用形態(tài)學方法和流式細胞術觀察和檢測了共培養(yǎng)體系中Jurkat T細胞的凋亡。 (1)Giemsa染色結果顯示，單獨培養(yǎng)的Jurkat T細胞形態(tài)均一，呈球形，核大，幾乎占據(jù)整個胞漿，呈均勻的紫黑色；共培養(yǎng)組JUrkatT細胞形態(tài)不均一，不規(guī)則細胞增多，核可見裂紋及固縮現(xiàn)象； (2)在熒光顯微鏡下，吖啶橙染色顯示：單獨培養(yǎng)組Jurkat T細胞的細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光，圓形，形態(tài)均一，胞漿呈橘紅

7、色或熒光不明顯；共培養(yǎng)組Jurkat T細胞形態(tài)不均一，可見細胞核綠色熒光呈半月型等固縮形態(tài)，并可見呈現(xiàn)弱熒光的細胞。 (3)流式細胞術檢測結果表明，Jurkat T細胞在單獨培養(yǎng)條件下的自然凋亡率較低(早期凋亡率為：5.57％，中晚凋亡率為：4.67％)，而各共培養(yǎng)組均表現(xiàn)出較高的凋亡率(早期凋亡率>10％，而中晚期凋亡率為50％左右)，兩者不管在早期或中晚期差異均有極顯著性；而共培養(yǎng)Gs組的Jurkat T細胞早期凋亡率為1

8、5.79％，與Control組比較(11.40％)有統(tǒng)計學差異，Bet組凋亡率與對照組無差異；而Gs組、Ber組Jurkat T細胞的中晚期凋亡率與Control組比較差異不明顯，但Gs組與Ber組的總凋亡率，即各期凋亡率總和，與Control組比較均有差異。結果提示，PG細胞可以誘導JurkatT細胞的凋亡，Gs和Ber均可以促進PG細胞誘導JurkatT細胞的凋亡。 3.免疫細胞化學法檢測PG細胞FasL、Fas分子的表達。

9、 (1)肺癌PG細胞有FasL，分子的表達，主要分布在胞漿；Gs和Ber均可使PG細胞FasL分子的陽性表達增強。 (2)Fas分子在PG細胞也有表達，主要分布在胞漿，胞膜亦有表達；Gs和Ber對Fas分子表達無明顯影響。 (3)FasL、Fas分子表達的圖像分析結果表明，Gs和Ber對FasL分子的表達有上調作用，與對照組比較差異有顯著性；Gs對Fas的表達亦有上調作用，而Ber無影響。結果提示，PG細胞有Fas

10、L、Fas分子的表達；Gs和Ber能促進FasL和/或Fas的表達。 4.運用ELISA法和放射性免疫法分別檢測PG細胞培養(yǎng)上清液中轉化生長因子β1(TGF-β1)和前列腺素E2(PGE2)的含量。結果顯示，PG細胞可分泌TGF-β1和PGE2，100μg/mlGs和5μg/ml、2.5μg/ml Ber均可以促進TGF-β1的分泌；但Gs和Ber各濃度組均對PGE2的分泌無影響。結果提示，PG細胞能分泌TGF-β1和PGE2，