杜仲葉綠原酸提取物及其主要組分聯(lián)全西紅花苷調(diào)脂作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察杜仲葉綠原酸提取物（CAEF）對大鼠胰脂酶活性的影響，以及CAEF及其主要組分（綠原酸、槲皮素、京尼平苷）與西紅花苷聯(lián)合配比物（C+C+G+Q）對HepG2細(xì)胞膽固醇代謝環(huán)節(jié)中相關(guān)基因與蛋白表達(dá)的影響，探討其調(diào)脂與減肥作用機(jī)制，以求為臨床血脂異常、肥胖癥和動脈粥樣硬化的防治提供新的候選藥物。
　　 方法:1.采用高脂乳劑及相應(yīng)藥物（CAEF20％，CAEF42％和奧利司他）灌胃SD大鼠3d，收集3d內(nèi)的糞便，測定其中總

2、脂、總膽固醇(TC)與膽汁酸含量，以評價(jià)藥物對腸道脂肪吸收以及對胰脂酶活性抑制的影響;2.培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，通過MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，以確定適宜的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量及時(shí)間，并取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定此條件下CAEF的有效濃度范圍;3.分別用相應(yīng)藥物對培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞干預(yù)48h后，油紅O染色觀察藥物對細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)積聚的影響;4.分別以相應(yīng)藥物干預(yù)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞24、48h后，測定細(xì)胞外液TC、TG的含量，觀察藥

3、物對細(xì)胞TC、TG外排的影響;5.RT-PCR測定ABCA1、SREBP2、CYP7A1、LXRα(NR1H3)、AMPKα2(PRKAA2)、HMGCR mRNA的表達(dá)量，觀察藥物對各基因表達(dá)的影響;6.免疫細(xì)胞化學(xué)和Western Blot觀察藥物對細(xì)胞HMGCR蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:1.CAEF(42％)組大鼠糞便中的總脂含量既高于高脂模型組又高于奧利司他組(P＜0.05)，糞便中膽固醇與膽汁酸的含量也明顯高于高脂

4、模型組(P＜0.05)，CAEF(42％)表現(xiàn)出良好的抑制腸道脂肪吸收和增加膽固醇與膽汁酸排泄的作用;2.MTT比色法確定2×104/mL為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞濃度，25mg/L CAEF為實(shí)驗(yàn)藥物濃度;3.油紅O染色觀察發(fā)現(xiàn)，CAEF與C+C+G+Q作用48h后，細(xì)胞內(nèi)的中性脂滴明顯減少，同時(shí)CAEF與C+C+G+Q的作用均強(qiáng)于辛伐他汀與相應(yīng)單組分，且C+C+G+Q強(qiáng)于CAEF;4.CAEF與C+C+G+Q分別作用24h、48h后，與對照組相比顯

5、著增加細(xì)胞TC、TG的外排(P＜0.05)，且其外排作用均明顯強(qiáng)于辛伐他汀與各單組分(P＜0.05);5.RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，CAEF和C+C+G+Q能顯著提高ABCA1、CYP7A1、AMPK2α mRNA表達(dá)(P＜0.05)，并明顯降低SREBP2、HMGCR mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，且對ABCA1與AMPKα2 mRNA表達(dá)的增強(qiáng)作用順序?yàn)?C+C+G+Q＞CAEF＞辛伐他汀(P＜0.05)，另外，C+C+G+Q還能下調(diào)

6、LXRα mRNA的表達(dá)(P＜0.05);6.免疫細(xì)胞化學(xué)法與Western Blot顯示CAEF與C+C+G+Q均能抑制HepG2細(xì)胞中HMGCR蛋白的表達(dá)，同時(shí)Western Blot也證明C+C+G+Q的抑制作用強(qiáng)于CAEF(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.CAEF對急性脂質(zhì)負(fù)荷大鼠和人肝癌HepG2細(xì)胞模型均有較強(qiáng)的調(diào)脂作用，能夠抑制大鼠腸道對外源性食物的脂質(zhì)吸收，增加膽固醇、膽汁酸的排泄，抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)中性脂肪

7、的積聚，增加HepG2細(xì)胞內(nèi)TC和TG外排;2.上述作用機(jī)制與CAEF抑制胰脂酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇代謝途徑的相關(guān)基因:上調(diào)ABCA1、CYP7A1、AMPKα2，下調(diào)SREBP2、HMGCR mRNA的表達(dá)，以及抑制細(xì)胞內(nèi)HMGCR蛋白的表達(dá)有關(guān);3.研究CAEF的調(diào)脂活性成分發(fā)現(xiàn)，CAEF的主要成分與西紅花苷聯(lián)合(C+C+G+Q)也能夠上調(diào)ABCA1、CYP7A1、AMPKα2并下調(diào)SREBP2、HMGCRmRNA的表達(dá)，同時(shí)C