LRIG1抑制EGFR入核增強順鉑對T24膀胱癌細胞損傷的研究.pdf

1、背景及目的:膀胱腫瘤患者近70％為表淺性，即非肌層浸潤性，多數(shù)患者能通過經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術等局部治療手段控制病情。余下的20-30％常伴有膀胱肌層侵犯，其中晚期患者常需要聯(lián)合全身化療才能控制病情，提高患者的生存率。順鉑是治療晚期侵襲性膀胱腫瘤的常用化療藥物，屬于引起DNA損傷的藥物之一。盡管順鉑有一定的療效，但由于藥物部分或完全耐受，僅有15％的晚期膀胱癌患者獲得完全緩解。最近的研究表明，多種引起DNA損傷的治療能導致表皮生長因子受體

2、（EGFR）入核，并引起DNA的損傷修復。因此，抑制EGFR 入核可能起到增強順鉑DNA損傷的能力，從而提高順鉑的療效。目前，抑制EGFR 入核的方法主要有抑制EGFR的激活以及抑制EGFR 酪氨酸激酶的活性兩種途徑。但目前尚無對抑制EGFR 入核誘導增強順鉑對膀胱腫瘤療效方面的研究。富含亮氨酸重復序列及免疫球蛋白樣結構域1（LRIG1）是EGFR的天然配體之一。其在膀胱腫瘤組織中表達缺失或者完全不表達。前期研究發(fā)現(xiàn)，在表淺性膀胱癌細胞

3、系BIU-87中上調LRIG1的表達水平能夠抑制腫瘤細胞的增殖，降低腫瘤細胞轉移及侵襲的能力。上述研究結果使假設，是否能通過LRIG1 抑制EGFR的活性，影響pEGFR的入核水平，增敏順鉑的療效。
　　 設計這個實驗目的在于，通過順鉑作用膀胱癌細胞系T24，研究其是否能導致DNA損傷后EGFR入核。在聯(lián)合LRIG1轉染后，觀察pEGFR入核是否能受到抑制，LRIG1是否能藉此增強順鉑誘導DNA損傷的能力。
　　 方法:

4、采用順鉑分別處理T24膀胱腫瘤細胞10，20和30分鐘，提取各組蛋白的核蛋白及總蛋白。免疫印跡法檢測細胞核蛋白內pEGFR的水平和總蛋白中EGFR的水平。而后采用腺病毒載體包裝LRIG1基因轉染T24細胞，并采用順鉑處理30分鐘后再次檢測pEGFR和EGFR表達水平，觀察LRIG1是否能抑制順鉑誘導的EGFR入核。另外為了研究這種現(xiàn)象的機制，我們采用蛋白酶體抑制劑MG132預處理T24細胞后再轉染LRIG1，目的在于觀察LRIG1是否通

5、過EGFR-蛋白酶體通路影響EGFR以及pEGFR的表達水平。
　　 最后，分別采用單細胞凝膠電泳檢測腫瘤細胞DNA損傷程度，熒光流式細胞分選術檢測腫瘤細胞周期以及細胞早期及晚期凋亡水平，免疫細胞化學法檢測腫瘤細胞增殖細胞核抗原（PCNA）的表達水平，Transwell小室法檢測腫瘤細胞的侵襲能力等。目的在于，觀察LRIG1抑制EGFR入核后，順鉑對DNA的損傷能力是否增強。
　　 結果:在經(jīng)過順鉑誘導10，20和30分

6、鐘后，T24膀胱腫瘤細胞核內的pEGFR表達水平明顯升高，但EGFR的整體表達水平無顯著變化。腺病毒載體成功包裝LRIG1基因后，將其轉染T24膀胱腫瘤細胞，再使用順鉑處理轉染后的細胞及對照組細胞，檢測其核內pEGFR表達水平及EGFR總量，觀察LRIG1是否能抑制EGFR入核。結果顯示，在轉染了LRIG1后，核內pEGFR的表達水平顯著下降，此外，EGFR的表達水平也顯著降低。此后，我們采用蛋白酶體抑制劑MG132，抑制在EGFR降解

7、過程中的關鍵酶體26S，觀察LRIG1是否通過降解EGFR抑制pEGFR入核?？梢奙G132處理后，LRIG1不能抑制EGFR降解，同時核內pEGFR的水平也維持在較高的水平。在LRIG1聯(lián)合順鉑處理T24細胞后，我們發(fā)現(xiàn)，單細胞凝膠電泳實驗中腫瘤細胞的OTM值顯著升高；細胞周期被抑制在S期；細胞早期和晚期的凋亡水平明顯升高；細胞PCNA的染色比例升高，但細胞增殖能力下降；細胞穿過Transwell小室的個數(shù)明顯減少，侵襲能力降低。