抗原呈遞元件基因甲基化對哈薩克族食管鱗癌發(fā)生的作用研究.pdf

1、目的：食管癌是較常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的發(fā)病率和死亡率居世界第一，每年約有16～20萬人死于此病。新疆是食管癌高發(fā)區(qū)之一，其中哈薩克族發(fā)病率最高，比其他少數(shù)民族高2～3倍，病死率在全國少數(shù)民族中占第一位。食管癌作為新疆的常見病和多發(fā)病，已嚴(yán)重影響了本地區(qū)各族人民的身體健康。哈薩克族生活習(xí)慣及居住環(huán)境特殊，是較好的研究人群。利用新疆哈薩克族食管癌疾病資源，開展食管癌的基礎(chǔ)研究，建立腫瘤分子標(biāo)志物體系，結(jié)合臨床研究來明確食管癌發(fā)病原

2、因，對于新疆食管癌的預(yù)防、診斷及臨床治療具有重大意義。食管癌的病因復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為食管癌是多因素作用、多基因參與、多階段發(fā)展的疾病，然而其發(fā)生和發(fā)展的確切機制仍不太清楚。在對哈薩克族食管癌高發(fā)區(qū)流行病學(xué)調(diào)查工作中，發(fā)現(xiàn)哈薩克族食管癌具有家族聚集現(xiàn)象，并且遺傳免疫因素在食管癌的發(fā)生中起著一定的作用。大量研究表明，人類白細(xì)胞抗原I類分子(human leukocyte antigen class I，HLA-I)表達(dá)低下或缺失，可導(dǎo)致腫瘤

3、細(xì)胞逃逸宿主免疫監(jiān)視，從而與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。HLA-I類分子是機體免疫應(yīng)答信息產(chǎn)生和傳遞的基礎(chǔ)，主要功能是將細(xì)胞內(nèi)源性抗原肽呈遞到細(xì)胞表面，實現(xiàn)CD8+T細(xì)胞對自身抗原的識別和免疫監(jiān)視。而此內(nèi)源性抗原肽呈遞過程必須在抗原呈遞元件(antigen processing machinery，APM)的協(xié)助下才能完成。APM成員蛋白是一組抗原呈遞相關(guān)蛋白，負(fù)責(zé)協(xié)助HLA-I類分子組裝、負(fù)載和提呈內(nèi)源性抗原肽，介導(dǎo)抗腫瘤的T細(xì)胞免疫功能。AP

4、M成員蛋白表達(dá)下調(diào)可影響正常的抗原呈遞過程，使腫瘤逃避免疫監(jiān)視而增加腫瘤發(fā)生和發(fā)展的風(fēng)險。DNA甲基化是腫瘤表觀遺傳學(xué)調(diào)控的一個重要方式，腫瘤細(xì)胞基因組整體水平低甲基化和啟動子區(qū)高甲基化是已被公認(rèn)的腫瘤表觀遺傳性機制。APM基因啟動子區(qū)的異常甲基化可引發(fā)基因表達(dá)沉默，導(dǎo)致功能蛋白的表達(dá)下調(diào)或缺失，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在宮頸癌、膀胱癌、頭、頸部腫瘤中已有報道，但有關(guān)食管癌的研究很少。本研究擬從表觀遺傳學(xué)角度，以HLA-I和APM成員

5、基因為候選基因，利用新疆哈薩克族食管癌病變資源，從基因表達(dá)調(diào)控層次，分析 APM成員基因啟動子區(qū)異常甲基化與哈薩克族食管鱗癌發(fā)生之間的關(guān)系。
　　方法：
　　(1)采用亞硫酸氫鹽測序PCR(bisulfate sequeneing PCR，BSP)法檢測人食管鱗癌ECa109細(xì)胞DNA中基因啟動子區(qū)甲基化位點。利用在線數(shù)據(jù)庫提供的人類基因組計劃資源，對HLA-B、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、ERAP1，Tapas

6、in和ERp57等8種基因啟動子區(qū)設(shè)計特異性PCR引物，經(jīng)基因啟動子區(qū)目的CpG島片段的PCR擴增、克隆和測序，獲得基因啟動子區(qū)甲基化相關(guān)的序列和CpG位點信息。
　　(2)收集新鮮哈薩克族食管癌及癌旁正常食管組織標(biāo)本50例，提取組織DNA。選取前一步研究中篩選出來的HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5種基因，利用MassARRAY甲基化檢測技術(shù)，對候選基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平進行定量分析，明確食管

7、癌和癌旁正常組織中總體及單個 CpG位點甲基化水平的差異。
　　(3)采用免疫組織化學(xué)SP法，檢測LMP7、Tapasin、ERp57和HLA-I蛋白在食管癌組織中的表達(dá)水平。使用 SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，采用非參數(shù)秩和檢驗分析以上4種蛋白表達(dá)水平與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系。采用Spearman等級相關(guān)分析檢驗 LMP7、Tapasin、ERp57與 HLA-I蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，采用方差分析檢驗LMP

8、7、Tapasin、ERp57基因甲基化和蛋白表達(dá)水平的關(guān)系。P值取雙側(cè)，以a=0.05為臨界值。
　　結(jié)果：
　　(1)在人食管鱗癌ECa109細(xì)胞DNA中，HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5種基因啟動子區(qū)的目的CpG島均發(fā)生了不同程度的甲基化，發(fā)生甲基化的CpG位點占所有CpG位點的比例分別為10/14、8/8、2/22、5/12和18/18。而TAP1、LMP2、ERAP1等3種基因啟動子區(qū)

9、沒有發(fā)現(xiàn)甲基化位點。
　　(2)根據(jù) MassARRAY技術(shù)對50例哈薩克族食管癌及癌旁正常組織中的甲基化定量檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)LMP7、Tapasin和ERp57基因在食管癌中的甲基化水平高于癌旁組織(P＜0.05)，HLA-B和TAP2基因在食管癌和癌旁組織中的甲基化水平無差異(P＞0.05)。進行單個CpG位點甲基化水平分析顯示：LMP7基因啟動子區(qū)CpG_5、CpG_9、CpG_20、CpG_21、CpG_22位點；Tapas

10、in基因啟動子區(qū)CpG_1、CpG_6位點；ERp57基因啟動子區(qū) CpG_1位點的甲基化水平在食管癌和癌旁正常組織之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。對3種基因甲基化水平與腫瘤臨床病理特征進行分析，發(fā)現(xiàn)LMP7和ERp57基因甲基化與食管癌患者TNM分期有關(guān)，I期+II期組的甲基化水平高于III期+IV期組；LMP7、ERp57基因甲基化與腫瘤分化程度有關(guān)，中、低分化組的甲基化水平高于高分化組；ERp57基因甲基化與腫瘤的血管侵襲性有

11、關(guān)，侵襲血管生長組的甲基化水平高于不侵襲血管生長組，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)免疫組化結(jié)果顯示：食管癌組織中HLA-I、Tapasin、LMP7和Erp57蛋白均有明顯的表達(dá)下調(diào)或缺失，與癌旁正常組織相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。HLA-I蛋白表達(dá)下調(diào)與腫瘤分化程度、腫瘤侵潤深度密切相關(guān)；LMP7蛋白表達(dá)下調(diào)與腫瘤分化程度、腫瘤侵潤深度、腫瘤血管侵襲性生長、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)；Tapasi

12、n蛋白表達(dá)下調(diào)與腫瘤分化程度、腫瘤侵潤深度密切相關(guān)；ERp57蛋白表達(dá)下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤血管侵襲性生長、腫瘤侵潤深度、TNM分期密切相關(guān)，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在食管癌組織中，HLA-I與LMP7、Tapasin、ERp57蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r值分別為0.823、0.721、0.378，P值均＜0.05)。LMP7、ERp57基因在不同甲基化水平之間的蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，隨著基因啟動子

13、區(qū)甲基化水平的增高，相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平降低。而 Tapasin基因在不同甲基化水平食管癌組織中的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)在人食管鱗癌ECa109細(xì)胞中，HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5種基因啟動子區(qū)的CpG島均發(fā)生了不同程度的CpG位點甲基化，可能是導(dǎo)致人食管鱗狀上皮細(xì)胞癌變的重要原因。
　　(2)在新疆哈薩克族食管癌組織標(biāo)本中，LMP7、Tap

14、asin和ERp57基因甲基化水平異常增高，并與腫瘤的臨床病理特征密切相關(guān)，是導(dǎo)致哈薩克族食管癌發(fā)生的高危因素。LMP7基因啟動子區(qū)的CpG_5、CpG_9、CpG_20、CpG_21、CpG_22位點；Tapasin基因啟動子區(qū)的CpG_1、CpG_6位點；ERp57基因啟動子區(qū)的CpG_1位點與基因的甲基化密切相關(guān)，可能是調(diào)控相應(yīng)基因啟動子區(qū)甲基化的關(guān)鍵位點。
　　(3)在新疆哈薩克族食管癌組織標(biāo)本中，HLA-I、LMP7、T

15、apasin和Erp57蛋白出現(xiàn)明顯的表達(dá)下調(diào)和缺失，并與食管癌的臨床病理特征密切相關(guān)，說明HLA-I及APM成員蛋白協(xié)同參與了食管鱗狀上皮的免疫應(yīng)答，可以防止食管癌的發(fā)生，對機體有保護作用。APM成員LMP7、ERp57基因啟動子區(qū)甲基化，可以抑制基因蛋白表達(dá)，影響HLA-I分子的組裝和呈遞，造成HLA-I在腫瘤細(xì)胞表面的下調(diào)或缺失，使腫瘤細(xì)胞逃避了機體的免疫監(jiān)視和殺傷，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，可能是新疆哈薩克族食管癌發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機制。