胱氨酸-谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11對格爾德霉素類化合物和氫醌的細胞毒性的影響.pdf

1、胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11位于胞膜上,把細胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)是其重要的功能之一。胱氨酸進入細胞內(nèi)很快就被還原為半胱氨酸,半胱氨酸是谷胱甘肽(GSH)合成的限速氨基酸?？梢?SLC7A11在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)GSH水平上起關鍵的作用,而GSH是機體防御系統(tǒng)的重要組成成分。因此,我們推斷SLC7A11可能參與機體的防御功能。
　　 格爾德霉素(Geldanamycin,GA)是一種由酵母產(chǎn)生的苯醌類化合物。GA和它的衍生物對

2、多種腫瘤細胞株和腫瘤組織都顯示出良好的抗腫瘤活性,被認為是新的抗腫瘤候選藥物而廣受關注。但是,在動物試驗中,GA表現(xiàn)出一定的肝毒性,并且對部分的腫瘤細胞有不同程度的耐藥性,從而限制了它們在臨床上的應用。因此闡明遺傳因素對其化學敏感性和耐藥性的影響,對優(yōu)化化療,減輕毒副作用具有重要的意義。本課題組研究發(fā)現(xiàn)SLC7A11的表達與GA的細胞增殖抑制作用呈明顯的負相關,但與GA的衍生物17AAG的細胞增殖抑制作用沒有明顯的相關性。可見,SLC7

3、A11可能與GA類化合物的化學敏感性和耐藥性有關,但是具體作用機制尚缺乏體內(nèi)外實驗證據(jù)。
　　 花色苷是多酚類植物化學物黃酮類家族最重要的家族成員,有多種生物學活性,其中抗氧化功能尤為突出。據(jù)文獻報道,花色苷可以通過Nrf2-ARE通路來誘導細胞抗氧化物酶HO-1、NQO1和GST的表達,從而發(fā)揮其抗氧化作用。那么對于同樣具有ARE序列的SLC7A11基因,花色苷足否也具有誘導作用呢?目前還未見文獻報道。
　　 氫醌(H

4、Q),又名對苯二酚,是一種用途廣泛的有機化工原料,也是苯的重要代謝產(chǎn)物。HQ在肝臟代謝時可產(chǎn)生活性氧(ROS),因此長期接觸可以造成肝損害。探討HQ引起肝氧化損傷的保護因素,對保護接觸人群和易感人群有重要的意義。那么具有抗氧化功能的花色苷是否對HQ引起的肝氧化性損傷有保護作用呢?SLC7A11在其中是否起一定的作用?這些問題均有待研究。
　　 本研究分成三個部分,第一部分通過生物信息學的方法對GA類化合物進行分析,再通過體外實驗

5、驗證分析結(jié)果,闡明SLC7A11是否在GA類化合物的細胞毒性中起作用,并初步探討其作用機制是否涉及自由基的生成和凋亡的誘導。第二部分探討SLC7A11是否在HQ引起的肝細胞氧化損傷起保護作用。第三部分探討花色苷是否對HQ引起的肝細胞氧化損傷起保護作用,SLC7A11是否在其中起一定的作用。
　　 研究方法:
　　 1.SLC7A11對GA類化合物的細胞毒性的影響
　　 (1)應用聚類分析、主成分分析和Pearso

6、n相關分析對化合物結(jié)構-功能和化合物-基因相關性進行分析。
　　 (2)采用兩種細胞株A549和HepG2,分別觀察SLC7A11高表達、低表達或活性受特異性抑制時17-O/H類化合物(如GA等)和17-N類化合物(如17-AAG等)引起的細胞增殖抑制、胞內(nèi)ROS水平和細胞凋亡的變化,比較不同SLC7A11表達水平或不同SLC7A111活性狀態(tài)對兩類GA類化合物的毒性效應的影響。
　　 (3)觀察抗氧化劑NAC和GSH合

7、成的特異性抑制劑BSO對GA和17-AAG引起的細胞增殖抑制、胞內(nèi)ROS水平、細胞凋亡的影響。
　　 (4)觀察上調(diào)或下調(diào)SLC7A11的表達后,或用NAC或BSO處理后,細胞內(nèi)GSH含量的變化。
　　 2.SLC7A11對氫醌的肝細胞毒性的影響
　　 采用一定濃度的HQ對SLC7A11正常表達的HepG2和SLC7A11高表達的HepG2S染毒,比較不同SLC7A11表達水平對HQ引起的細胞增殖、胞內(nèi)ROS水平

8、、胞內(nèi)MDA含量及細胞凋亡變化的影響。
　　 3.花色苷對HepG2細胞SLC7A11表達的影響及其對HQ的肝細胞氧化損傷作用的影響
　　 觀察不同濃度花色苷處理HepG2后SLC7A11的蛋白水平的變化。比較不同濃度的花色苷預處理HepG2細胞后對HQ引起細胞增殖、胞ROS水平、胞內(nèi)MDA的含量以及細胞凋亡變化的影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.SLC7A11對GA類化合物的細胞毒性的影響
　　

9、 (1)生物信息學分析結(jié)果:通過聚類分析和主成分分析,可把18種GA類化合物按C-17取代基的不同分為兩組:17-O/H類化合物和17-N類化合物。根據(jù)基因表達-化合物細胞毒性的相關分析,發(fā)現(xiàn)在NCI-60中SLC7A11的表達與絕大多數(shù)17-O/H類化合物的細胞毒性呈強的負相關(8/10),而僅與1種17-N類化合物的細胞毒性呈相對弱的負相關。
　　 (2)SLC7A11對GA類化合物細胞毒性的影響:下調(diào)SL7A11的表達或

10、抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)運活性后可增強17-O/H類化合物(如GA等)對A549細胞的增殖抑制作用(P<0.05)、增加ROS生成量(P<0.05)、提高細胞凋亡率(P<0.05)；上調(diào)SLC7A11的表達后可降低HepG2細胞對GA的敏感性(P<0.05)、減少ROS的生成量(P<0.05),降低細胞凋亡率(P<0.05)。上述各種變化對17-N類化合物(如17AAG等)引起的細胞毒性效應無明顯影響(P>0.05)。
　　 (3

11、)NAC和BSO對GA類化合物細胞毒性的影響:NAC可以降低GA對細胞的增殖抑制作用(P<0.05)、減少ROS的生成量(P<0.05)、降低細胞凋亡率(P<0.05),但對17AAG引起的相關效應無明顯影響(P>0.05)；BSO對GA的細胞增殖抑制作用的影響明顯大于17AAG,并且可以增加GA誘發(fā)的ROS生成量(P<0.05)、提高細胞凋亡率(P<0.05),而對17AAG的相關效應無明顯影響(P>0.05)。
　　 (4)

12、各種處理因素對細胞內(nèi)GSH水平的影響:下調(diào)SLC7A11表達或用BSO處理均可降低細胞內(nèi)GSH的水平(P<0.05)；上調(diào)SLC7A11表達或用NAC處理均可使細胞內(nèi)GSH的水平升高(P<0.05)。
　　 2.SLC7A11對氫醌的肝細胞毒性具有保護作用
　　 在一定的濃度范圍內(nèi),HQ可以抑制HepG2細胞的增殖,增加胞內(nèi)的ROS水平和MDA含量,誘導HepG2細胞凋亡,并呈明顯的劑量.效應關系。但是上調(diào)SLC7A11

13、的表達水平可以減輕HQ對細胞增殖的抑制,遏制HQ的氧化損傷作用和抑制HQ誘導的細胞凋亡。
　　 3.花色苷減輕HQ的肝細胞氧化損傷作用
　　 花色苷可以誘導HepG2細胞SLC7A11的表達,呈劑量.效應關系?；ㄉ湛梢詼p輕HQ引起的細胞增殖抑制作用,抑制HQ誘導的氧化損傷和細胞凋亡,并呈明顯的劑量-效應關系。
　　 結(jié)論:
　　 1.建立了一套有效的研究化合物的細胞毒性及其與基因的相互關系的方法:通過數(shù)

14、據(jù)挖掘技術篩選靶化合物,然后進行結(jié)構.活性分析和基因表達-化合物細胞毒性相關分析,之后通過RNAi技術、特異性抑制劑和靶基因?qū)爰夹g進行基因功能性分析和驗證的細胞實驗。
　　 2.根據(jù)C—17位的側(cè)鏈基團和對NCI-60的GI50,把GA類化合物分為17-O/H類化合物和17-N類化合物兩大類。SLC7A11參與了17-O/H類化合物的細胞毒性的調(diào)節(jié),而對17-N類化合物的細胞毒性無明顯的影響。
　　 3.GA比17-A