胱氨酸-谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11對(duì)格爾德霉素類化合物和氫醌的細(xì)胞毒性的影響.pdf

1、胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11位于胞膜上,把細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)是其重要的功能之一。胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)很快就被還原為半胱氨酸,半胱氨酸是谷胱甘肽(GSH)合成的限速氨基酸。可見,SLC7A11在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GSH水平上起關(guān)鍵的作用,而GSH是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成成分。因此,我們推斷SLC7A11可能參與機(jī)體的防御功能。
　　 格爾德霉素(Geldanamycin,GA)是一種由酵母產(chǎn)生的苯醌類化合物。GA和它的衍生物對(duì)

2、多種腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織都顯示出良好的抗腫瘤活性,被認(rèn)為是新的抗腫瘤候選藥物而廣受關(guān)注。但是,在動(dòng)物試驗(yàn)中,GA表現(xiàn)出一定的肝毒性,并且對(duì)部分的腫瘤細(xì)胞有不同程度的耐藥性,從而限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用。因此闡明遺傳因素對(duì)其化學(xué)敏感性和耐藥性的影響,對(duì)優(yōu)化化療,減輕毒副作用具有重要的意義。本課題組研究發(fā)現(xiàn)SLC7A11的表達(dá)與GA的細(xì)胞增殖抑制作用呈明顯的負(fù)相關(guān),但與GA的衍生物17AAG的細(xì)胞增殖抑制作用沒有明顯的相關(guān)性?？梢?SLC7

3、A11可能與GA類化合物的化學(xué)敏感性和耐藥性有關(guān),但是具體作用機(jī)制尚缺乏體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 花色苷是多酚類植物化學(xué)物黃酮類家族最重要的家族成員,有多種生物學(xué)活性,其中抗氧化功能尤為突出。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,花色苷可以通過Nrf2-ARE通路來誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化物酶HO-1、NQO1和GST的表達(dá),從而發(fā)揮其抗氧化作用。那么對(duì)于同樣具有ARE序列的SLC7A11基因,花色苷足否也具有誘導(dǎo)作用呢?目前還未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 氫醌(H

4、Q),又名對(duì)苯二酚,是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料,也是苯的重要代謝產(chǎn)物。HQ在肝臟代謝時(shí)可產(chǎn)生活性氧(ROS),因此長(zhǎng)期接觸可以造成肝損害。探討HQ引起肝氧化損傷的保護(hù)因素,對(duì)保護(hù)接觸人群和易感人群有重要的意義。那么具有抗氧化功能的花色苷是否對(duì)HQ引起的肝氧化性損傷有保護(hù)作用呢?SLC7A11在其中是否起一定的作用?這些問題均有待研究。
　　 本研究分成三個(gè)部分,第一部分通過生物信息學(xué)的方法對(duì)GA類化合物進(jìn)行分析,再通過體外實(shí)驗(yàn)

5、驗(yàn)證分析結(jié)果,闡明SLC7A11是否在GA類化合物的細(xì)胞毒性中起作用,并初步探討其作用機(jī)制是否涉及自由基的生成和凋亡的誘導(dǎo)。第二部分探討SLC7A11是否在HQ引起的肝細(xì)胞氧化損傷起保護(hù)作用。第三部分探討花色苷是否對(duì)HQ引起的肝細(xì)胞氧化損傷起保護(hù)作用,SLC7A11是否在其中起一定的作用。
　　 研究方法:
　　 1.SLC7A11對(duì)GA類化合物的細(xì)胞毒性的影響
　　 (1)應(yīng)用聚類分析、主成分分析和Pearso

6、n相關(guān)分析對(duì)化合物結(jié)構(gòu)-功能和化合物-基因相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　 (2)采用兩種細(xì)胞株A549和HepG2,分別觀察SLC7A11高表達(dá)、低表達(dá)或活性受特異性抑制時(shí)17-O/H類化合物(如GA等)和17-N類化合物(如17-AAG等)引起的細(xì)胞增殖抑制、胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞凋亡的變化,比較不同SLC7A11表達(dá)水平或不同SLC7A111活性狀態(tài)對(duì)兩類GA類化合物的毒性效應(yīng)的影響。
　　 (3)觀察抗氧化劑NAC和GSH合

7、成的特異性抑制劑BSO對(duì)GA和17-AAG引起的細(xì)胞增殖抑制、胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡的影響。
　　 (4)觀察上調(diào)或下調(diào)SLC7A11的表達(dá)后,或用NAC或BSO處理后,細(xì)胞內(nèi)GSH含量的變化。
　　 2.SLC7A11對(duì)氫醌的肝細(xì)胞毒性的影響
　　 采用一定濃度的HQ對(duì)SLC7A11正常表達(dá)的HepG2和SLC7A11高表達(dá)的HepG2S染毒,比較不同SLC7A11表達(dá)水平對(duì)HQ引起的細(xì)胞增殖、胞內(nèi)ROS水平

8、、胞內(nèi)MDA含量及細(xì)胞凋亡變化的影響。
　　 3.花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞SLC7A11表達(dá)的影響及其對(duì)HQ的肝細(xì)胞氧化損傷作用的影響
　　 觀察不同濃度花色苷處理HepG2后SLC7A11的蛋白水平的變化。比較不同濃度的花色苷預(yù)處理HepG2細(xì)胞后對(duì)HQ引起細(xì)胞增殖、胞ROS水平、胞內(nèi)MDA的含量以及細(xì)胞凋亡變化的影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.SLC7A11對(duì)GA類化合物的細(xì)胞毒性的影響
　　

9、 (1)生物信息學(xué)分析結(jié)果:通過聚類分析和主成分分析,可把18種GA類化合物按C-17取代基的不同分為兩組:17-O/H類化合物和17-N類化合物。根據(jù)基因表達(dá)-化合物細(xì)胞毒性的相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)在NCI-60中SLC7A11的表達(dá)與絕大多數(shù)17-O/H類化合物的細(xì)胞毒性呈強(qiáng)的負(fù)相關(guān)(8/10),而僅與1種17-N類化合物的細(xì)胞毒性呈相對(duì)弱的負(fù)相關(guān)。
　　 (2)SLC7A11對(duì)GA類化合物細(xì)胞毒性的影響:下調(diào)SL7A11的表達(dá)或

10、抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)運(yùn)活性后可增強(qiáng)17-O/H類化合物(如GA等)對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用(P<0.05)、增加ROS生成量(P<0.05)、提高細(xì)胞凋亡率(P<0.05)；上調(diào)SLC7A11的表達(dá)后可降低HepG2細(xì)胞對(duì)GA的敏感性(P<0.05)、減少ROS的生成量(P<0.05),降低細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。上述各種變化對(duì)17-N類化合物(如17AAG等)引起的細(xì)胞毒性效應(yīng)無明顯影響(P>0.05)。
　　 (3

11、)NAC和BSO對(duì)GA類化合物細(xì)胞毒性的影響:NAC可以降低GA對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用(P<0.05)、減少ROS的生成量(P<0.05)、降低細(xì)胞凋亡率(P<0.05),但對(duì)17AAG引起的相關(guān)效應(yīng)無明顯影響(P>0.05)；BSO對(duì)GA的細(xì)胞增殖抑制作用的影響明顯大于17AAG,并且可以增加GA誘發(fā)的ROS生成量(P<0.05)、提高細(xì)胞凋亡率(P<0.05),而對(duì)17AAG的相關(guān)效應(yīng)無明顯影響(P>0.05)。
　　 (4)

12、各種處理因素對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響:下調(diào)SLC7A11表達(dá)或用BSO處理均可降低細(xì)胞內(nèi)GSH的水平(P<0.05)；上調(diào)SLC7A11表達(dá)或用NAC處理均可使細(xì)胞內(nèi)GSH的水平升高(P<0.05)。
　　 2.SLC7A11對(duì)氫醌的肝細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用
　　 在一定的濃度范圍內(nèi),HQ可以抑制HepG2細(xì)胞的增殖,增加胞內(nèi)的ROS水平和MDA含量,誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡,并呈明顯的劑量.效應(yīng)關(guān)系。但是上調(diào)SLC7A11

13、的表達(dá)水平可以減輕HQ對(duì)細(xì)胞增殖的抑制,遏制HQ的氧化損傷作用和抑制HQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 3.花色苷減輕HQ的肝細(xì)胞氧化損傷作用
　　 花色苷可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞SLC7A11的表達(dá),呈劑量.效應(yīng)關(guān)系?；ㄉ湛梢詼p輕HQ引起的細(xì)胞增殖抑制作用,抑制HQ誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡,并呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1.建立了一套有效的研究化合物的細(xì)胞毒性及其與基因的相互關(guān)系的方法:通過數(shù)

14、據(jù)挖掘技術(shù)篩選靶化合物,然后進(jìn)行結(jié)構(gòu).活性分析和基因表達(dá)-化合物細(xì)胞毒性相關(guān)分析,之后通過RNAi技術(shù)、特異性抑制劑和靶基因?qū)爰夹g(shù)進(jìn)行基因功能性分析和驗(yàn)證的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　 2.根據(jù)C—17位的側(cè)鏈基團(tuán)和對(duì)NCI-60的GI50,把GA類化合物分為17-O/H類化合物和17-N類化合物兩大類。SLC7A11參與了17-O/H類化合物的細(xì)胞毒性的調(diào)節(jié),而對(duì)17-N類化合物的細(xì)胞毒性無明顯的影響。
　　 3.GA比17-A