miRNA-34a-KLF4在X射線誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡時(shí)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　探討miR-34a/KLF4在X射線外照射誘發(fā)小鼠肝細(xì)胞凋亡時(shí)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明miR-34a在電離輻射損傷發(fā)生中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并推動(dòng)以其為靶點(diǎn)的輻射損傷救治新手段的探索。
　　方法：
　　1.雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a對(duì)KLF4的靶向作用。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物和抑制劑后，Real-Time PCR方法檢miR-34a和KLF4 mRNA表達(dá)，west

2、ern blot蛋白印記法檢測(cè)KLF4蛋白表達(dá)。
　　2.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝細(xì)胞，經(jīng)10Gy X射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，Real-Time PCR方法檢測(cè)miR-34a表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物和抑制劑后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)10Gy X射線照射小鼠肝細(xì)胞凋亡變化。慢病毒干擾KLF4后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)10Gy X射線照射小鼠肝細(xì)胞凋亡變化。
　　結(jié)果：
　　1.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)

3、，發(fā)現(xiàn)miR-34a在KLF4-3'UTR有一個(gè)序列保守的潛在靶位點(diǎn)。為了驗(yàn)證miR-34a和KLF4的靶點(diǎn)作用關(guān)系，構(gòu)建了含KLF4-3'UTR結(jié)合序列的報(bào)告基因質(zhì)粒。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-34a可顯著抑制KLF4-3'UTR結(jié)合序列的報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性。此外，實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR)及免疫印跡(western blot)分析結(jié)果顯示，肝細(xì)胞內(nèi)KLF4的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均受到miR-34

4、a的抑制。
　　2.小鼠肝細(xì)胞系BNL CL.2經(jīng)10Gy X射線照射后，miR-34a的表達(dá)顯著上升。可見(jiàn)，10Gy X射線照射可上調(diào)肝細(xì)胞中 miR-34a的表達(dá)水平。分別利用成熟miR-34a模擬物(miR-34a mimics)過(guò)表達(dá)和miR-34a抑制劑(miR-34a inhibitor)下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)源miR-34a的水平并檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況的變化。結(jié)果顯示，miR-34a模擬物可顯著促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。相反，miR-34