胚胎心臟流出道、靜脈竇及傳導(dǎo)系的發(fā)生發(fā)育.pdf

1、胚胎心臟發(fā)育過程中，流出道經(jīng)復(fù)雜的分隔和結(jié)構(gòu)重建，參與心包內(nèi)升主動脈和肺動脈干、左右心室流出道及動脈瓣膜結(jié)構(gòu)的發(fā)育。流出道發(fā)育和分隔異常將導(dǎo)致永久性動脈干，右心室雙流出道，室間隔缺損，主動脈和肺動脈易位，法洛氏四聯(lián)癥等多種先天性心臟病。由于轉(zhuǎn)基因或基因敲除后對胚胎發(fā)育影響的復(fù)雜性和不同動物的種屬差異，對心臟流出道的正常發(fā)育機理尚有許多爭議。受精后前8周是人胚心臟流出道發(fā)育、分隔和重建的重要時期。對人胚心臟流出道發(fā)育和分隔機理的探討大多局

2、限于較大胚齡的胚胎，缺乏對早期人胚心臟流出道正常發(fā)育和分隔機理的系統(tǒng)研究。探討胚胎早期心臟流出道的正常發(fā)育和分隔機理不但是重要的基礎(chǔ)理論研究，也可為探討流出道發(fā)育和分隔異常導(dǎo)致的先天性心臟病的發(fā)病機理提供理論依據(jù)，對此類先天性心臟病的預(yù)防和治療有重要意義。 有研究認為靜脈竇心肌來自后生心區(qū)的間充質(zhì)，受獨特的基因調(diào)控，也有著者否認哺乳類動物心臟發(fā)育過程中靜脈竇結(jié)構(gòu)的存在。以往對人胚心臟發(fā)育的研究多集中在C14期(Carnegies

3、tage14)后較大胎齡的胚胎，此時靜脈竇已經(jīng)并入右心房，因此這些研究并沒有觀察到靜脈竇的早期發(fā)育。結(jié)蛋白(DES)基因突變導(dǎo)致結(jié)蛋白性心肌病，常伴有不同程度的心臟傳導(dǎo)障礙和心律失常，嚴重時引起猝死，其原因不明。 本實驗第一章通過觀察α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、α-橫紋肌肌動蛋白(α-SCA)、肌球蛋白重鏈(MHC)和Caspase-3(CAS-3)在C10期—4216期(排卵后22±1～37天)人胚心臟、咽中胚層的時空表

4、達型及各期心臟和咽中胚層HE染色的形態(tài)學(xué)特征，探討了人胚心臟流出道增長的機制、心內(nèi)膜墊的發(fā)育及動脈囊的分隔。本實驗第二章通過觀察α-SMA、α=SCA和DES在C10～C16期人胚心臟的時空表達型，探討了人胚心臟靜脈竇的發(fā)生、分化及傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育。第三章通過觀察α-SMA、α-SCA、MHC、GATA—4、CAS-3、增殖細胞核抗原(PCNA)在胚齡9～12天小鼠胚胎心臟的時空表達型探討了小鼠胚胎心臟流出道的縮短機制。 第一章人

5、胚早期心臟流出道的發(fā)育 取29例C10期—C16期(Carnegiestage10～Carnegiestage16，排卵后22±1～37天)人胚心臟連續(xù)切片，用抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、抗α-橫紋肌肌動蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重鏈(MHC)和抗活性Caspase-3(CAS-3)抗體進行免疫組織化學(xué)染色，并用HE染色觀察了各期心臟及咽中胚層的形態(tài)學(xué)特征，以探討心包腔背側(cè)臟壁中胚層上皮、咽前間充質(zhì)及動脈囊與心肌性流

6、出道發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果顯示：人胚發(fā)育C10期℃15期，由于流出道、動脈囊由頸部向胸部移位以及心包腔向胚胎背側(cè)的逐漸擴展，使位于原始咽前方間充質(zhì)中的動脈囊逐漸突向心包腔內(nèi)，動脈囊表面的心包腔背側(cè)臟壁中胚層上皮不斷分化為α-SMA、α-SCA和MHC陽性的流出道心肌細胞。心包腔臟壁中胚層上皮向心肌細胞的分化在C16期人胚終止。人胚C10晚期～C12期，流出道遠端的臟層心包和心包腔的背側(cè)壁為復(fù)層上皮，向壁層心包內(nèi)延伸逐漸變?yōu)閱螌颖馄缴掀?。背?cè)心

7、包于C13期～C15期變?yōu)閱螌由掀ぁＨ伺逤10晚期～C13期，流出道遠端α-SMA和α-SCA表達可延伸至臟層心包及咽部間充質(zhì)細胞，流出道逐漸延長。人胚C14期～C15期，流出道明顯延長，其遠端的臟層心包細胞增生并遷至流出道，在近流出道心肌細胞處表達α-SMA和α-SCA。遷移至流出道動脈端前后壁的間充質(zhì)在C15期人胚發(fā)生凋亡，可見流出道心肌細胞遷入間充質(zhì)細胞團內(nèi)，取代凋亡的間充質(zhì)細胞。α-SMA陽性神經(jīng)嵴細胞在C12期人胚心臟流出道心

8、內(nèi)膜墊中開始出現(xiàn)，隨發(fā)育逐漸增多并在局部聚集形成兩條縱形的螺旋狀走形的嵴。人胚C15期～C16期，動脈囊后壁的α-SMA陽性神經(jīng)嵴細胞向動脈囊內(nèi)增生，形成主肺動脈隔，將動脈囊分隔為心包內(nèi)升主動脈及肺動脈干。因此我們認為：心包腔背側(cè)臟壁中胚層是人胚心臟第二生心區(qū)，可不斷分化為心肌細胞，使胚胎心肌性流出道長度增加。細胞凋亡染色提示并非所有遷入流出道的咽前間充質(zhì)細胞都可分化為心肌細胞。流出道遠端心肌可誘導(dǎo)第二生心區(qū)或稱前心區(qū)細胞增殖分化為心肌

9、細胞。α-SMA陽性神經(jīng)嵴細胞出現(xiàn)在流出道心內(nèi)膜墊和主肺動脈隔的時間不同，提示神經(jīng)嵴細胞經(jīng)不同路線遷移至流出道嵴和主肺動脈隔。 第二章人胚心臟靜脈竇和傳導(dǎo)系統(tǒng)的早期發(fā)育 用抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、抗α-橫紋肌肌動蛋白(α-SCA)和抗結(jié)蛋白(DES)抗體對29例C10期～C16期(Carnegiestage10℃amegiestage16，排卵后22±1～37天)人胚心臟連續(xù)切片進行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示

10、：人胚發(fā)育C12期～213期，系統(tǒng)靜脈匯集形成的靜脈竇出現(xiàn)于心包腔尾端原始橫膈間充質(zhì)中，靜脈竇壁間充質(zhì)細胞逐漸分化為α-SCA陽性的靜脈竇心肌細胞。人胚C14期，心包腔的擴張使靜脈竇進入心包腔內(nèi)，參與了右心房的形成。DES陽性傳導(dǎo)系心肌的分化始于C10期人胚心臟房室管右側(cè)壁，隨發(fā)育逐漸向室間溝心肌擴展，發(fā)育為房室傳導(dǎo)系統(tǒng)的希氏束、左右束支及心室腔面的小梁心肌。在心房，DES表達首先出現(xiàn)于C11期人胚心房背側(cè)壁，在C13期人胚，可見靜脈竇

11、左背側(cè)壁α-SCA、α-SMA、DES陽性心肌帶與左心房底部、房室管背側(cè)壁相延續(xù)，可能這條心肌帶參與了人胚心臟靜脈竇至房室管傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育。人胚發(fā)育C14～C16期，DES強陽性染色從竇房結(jié)經(jīng)左、右靜脈瓣及心房的背、腹側(cè)壁延伸至房室管右側(cè)壁，可能是原始的心房傳導(dǎo)通路。因此我們認為，心包腔尾端原始橫膈間充質(zhì)是人胚靜脈竇心肌發(fā)生區(qū)，原始橫膈間充質(zhì)細胞逐漸分化為心肌細胞，添加到人胚心管靜脈端，形成心臟靜脈竇心肌。人胚心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)心肌的分化始于

12、房室管，隨心管發(fā)育逐漸向動、靜脈端擴展，在人胚發(fā)育C16期，已分化為形態(tài)學(xué)清晰可辨的DES陽性胚胎心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。 第三章小鼠胚胎心臟流出道早期并入右心室 用抗α-橫紋肌肌節(jié)肌動蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重鏈(MHC)抗體標記心肌，用抗GATA—4抗體標記心肌及其前體細胞，用抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體標記早期心肌細胞，抗增殖細胞核抗原(PCNA)抗體顯示增殖細胞，用抗人/鼠活性CaSpase-3(CAS-3

13、)抗體檢測凋亡早期細胞，對胚齡9～12天(胚齡12天分別取8時、12時、16時、20時胚胎)小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進行了免疫組織化學(xué)PAP法染色。結(jié)果顯示：①小鼠胚胎心臟流出道于胚齡12天8時～20時明顯縮短。②在流出道縮短前及縮短過程中流出道全長均未檢測到CAS-3陽性細胞。⑦胚齡11天至胚齡12天8時，動脈囊陷入心包腔，GATA—4、α-SCA、α-SMA、MHC染色示流出道遠端心肌界向心室方向退縮至心包腔內(nèi)，GATA—4染色示流出道

14、遠端心肌未轉(zhuǎn)分化為大血管壁的細胞成分，可見第二生心區(qū)來源的間充質(zhì)細胞不斷分化為心肌細胞添加在心臟的動脈端使流出道延長。④胚齡11～12天，α-SMA陽性心神經(jīng)嵴細胞逐漸從流出道遠端遷入，GATA—4、α-SCA、α-SMA、MHC、PCNA染色表明流出道近段心肌不斷增生形成小梁侵入鄰近的流出道嵴內(nèi)，使流出道嵴心肌化而并入右心室；胚齡12天，在近流出道心肌處，可見與流出道心肌相延續(xù)的α-SCA、α-SMA弱陽性間充質(zhì)細胞流，高倍光鏡下可見

15、其細胞突起向心肌細胞延伸或靠近甚至接觸；胚齡12天流出道嵴內(nèi)可見散在的α-SCA、α-SMA、GATA—4陽性細胞，表明流出道嵴內(nèi)的間充質(zhì)細胞在不斷轉(zhuǎn)分化為心肌細胞。因此我們認為流出道嵴愈合形成間充質(zhì)性流出道隔前，其近段即在通過心肌化、間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為心肌細胞不斷肌化，使流出道由近向遠并入了右心室，心肌性流出道逐漸縮短，流出道遠端界逐漸向心室方向退縮。流出道近段嵴內(nèi)間充質(zhì)細胞向心肌細胞的轉(zhuǎn)分化受心肌細胞直接接觸及釋放的因子的調(diào)節(jié)。心肌