胚胎心流出道的形態(tài)發(fā)生與呼吸內(nèi)胚層發(fā)育偶聯(lián).pdf

1、原腸胚期三胚層胚盤頭端及兩側(cè)的半月形生心中胚層構(gòu)成第一生心區(qū)，形成的原始心管僅為左心室原基。位于原始心管頭端和背側(cè)的臟壁中胚層間充質(zhì)構(gòu)成第二生心區(qū)，不斷向心管添加心肌細(xì)胞，形成流出道、右心室、部分心房等結(jié)構(gòu)，但第一生心區(qū)和第二生心區(qū)在胚胎發(fā)生過程中的形態(tài)學(xué)關(guān)系，所見報道較少。心肌前體細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化以及正常心形態(tài)發(fā)生受多種信號系統(tǒng)及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)錄因子ISL-1是第二生心區(qū)心肌前體細(xì)胞較好的標(biāo)記蛋白，GATA4與NKx2.5

2、是心肌前體細(xì)胞和心肌細(xì)胞較好的標(biāo)記蛋白，調(diào)控第一和第二生心區(qū)心肌前體細(xì)胞的增生及向心肌細(xì)胞的分化。GATA4、Nkx2.5和ISL-1基因突變或基因敲除引發(fā)先天性心臟畸形或胚胎死亡。第一、第二生心區(qū)心肌前體細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化及心的正常形態(tài)發(fā)生需內(nèi)胚層的誘導(dǎo)。在發(fā)育早期去除內(nèi)胚層，不能形成正常搏動的心管。有關(guān)前腸內(nèi)胚層對心管發(fā)育的誘導(dǎo)作用主要集中在對多種信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的研究，條件性敲除前腸內(nèi)胚層的一些信號分子或轉(zhuǎn)錄因子基因，小鼠胚胎

3、流出道、右心室及弓動脈發(fā)育畸形，因此認(rèn)為，前腸內(nèi)胚層通過不同的分泌信號分子或轉(zhuǎn)錄因子作用于心肌前體細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化和心的形態(tài)發(fā)生。有關(guān)前腸內(nèi)胚層發(fā)育與心臟發(fā)育關(guān)系的研究主要限于對兩棲類、雞胚的體外觀察及對敲除內(nèi)胚層相關(guān)基因小鼠的觀察，對正常小鼠前腸內(nèi)胚層在誘導(dǎo)胚胎心肌細(xì)胞分化和心發(fā)生過程中的形態(tài)學(xué)變化，以及在心形態(tài)發(fā)生過程中與第一、第二生心區(qū)發(fā)育的相互形態(tài)學(xué)關(guān)系的研究未見報道。本研究探討了第一生心區(qū)和第二生心區(qū)在胚胎發(fā)生過程中的形

4、態(tài)學(xué)關(guān)系，以及前腸內(nèi)胚層發(fā)育對小鼠胚胎心流出道的發(fā)生與分隔的影響，為闡明前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)心正常發(fā)育的理論提供形態(tài)學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步探討由于流出道分隔異常而導(dǎo)致的動脈干永存等先天畸形發(fā)生機(jī)制的胚胎學(xué)起源提供一定的形態(tài)和理論基礎(chǔ)。
　　 對GATA4在心早期發(fā)育過程中的研究，主要集中在對體外培養(yǎng)或敲基因、轉(zhuǎn)基因小鼠的表型觀察及mRNA水平，且缺乏系統(tǒng)的報道，對GATA4蛋白在胚胎早期動脈端發(fā)育過程中時空表達(dá)規(guī)律以及與Nkx2.5表達(dá)的

5、關(guān)系也缺乏系統(tǒng)觀察。GATA4可促進(jìn)前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的生長，前腸內(nèi)胚層可誘導(dǎo)第一、第二生心區(qū)心肌前體細(xì)胞的分化和心的正常發(fā)育，對正常小鼠GATA4蛋白在前腸內(nèi)胚層的時空表達(dá)特點(diǎn)及GATA4陽性內(nèi)胚層與心早期發(fā)育的形態(tài)學(xué)關(guān)系尚未見報道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)結(jié)合Westernblotting方法，觀察了GATA4在小鼠胚胎生心區(qū)及前腸內(nèi)胚層的時空表達(dá)特點(diǎn)，探討了GATA4的表達(dá)與心動脈端發(fā)育、分隔的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)心正常發(fā)育

6、的理論提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)第一部分應(yīng)用免疫組織化學(xué)及免疫熒光方法，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(Islet-l，ISL-1)、Nkx2.5、α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、心肌肌球蛋白重鏈(myosinheavychain，MHC)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)在心肌分化過程中的表達(dá)特點(diǎn)，研究了前腸呼吸內(nèi)胚層的發(fā)

7、育與小鼠胚胎心流出道的形態(tài)發(fā)生關(guān)系。第二部分，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、免疫熒光和WesternBlotting方法，結(jié)合GATA4、Nkx2.5、ISL-1，α-SMA和MHC在小鼠胚胎第一生心區(qū)、第二生心區(qū)及前腸內(nèi)胚層的時空表達(dá)特點(diǎn)，以及GATA4和磷酸化組蛋白H3(PHH3)在胚齡11～14天小鼠胚胎心的表達(dá)，探討了轉(zhuǎn)錄因子GATA4在生心區(qū)及前腸內(nèi)胚層的表達(dá)與小鼠胚胎動脈端發(fā)育的形態(tài)學(xué)關(guān)系。
　　 第一部分:
　　 小鼠

8、胚胎心流出道的形態(tài)發(fā)生與呼吸內(nèi)胚層發(fā)育偶聯(lián)
　　 用抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重鏈(MHC)、抗轉(zhuǎn)錄因子胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(ISL-1)、抗Nkx2.5及抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體對胚齡7.5～13天小鼠胚胎心連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)PAP法或免疫熒光染色。結(jié)果顯示:胚胎發(fā)育7.5天，ISL-1表達(dá)于生心板心肌前體細(xì)胞和體壁中胚層。隨胚盤側(cè)褶形成，ISL-1陽性表達(dá)由生心板向胚內(nèi)體腔內(nèi)側(cè)壁及前腸兩

9、側(cè)間充質(zhì)擴(kuò)展，發(fā)育為心包腔背側(cè)壁及咽兩側(cè)ISL-1陽性的第二生心區(qū)間充質(zhì)，并保持較高的增生活性。胚齡9～10天，MHC表達(dá)陽性的心肌延伸至流出道與心背系膜的返折處，與ISL-1、NKx2.5表達(dá)重疊。胚胎發(fā)育11天后，ISL-1和α-SMA陽性表達(dá)的流出道遠(yuǎn)端，失去MHC表達(dá)。11天后，前腸腹側(cè)ISL-1陽性錐體形結(jié)構(gòu)的頭端、尾端分別延伸至動脈囊頭尾側(cè)壁，并伸入動脈囊腔。在胚胎發(fā)育12～13天，錐體形結(jié)構(gòu)的IS1-1陽性心肌前體細(xì)胞遷移

10、至心包內(nèi)升主動脈和肺動脈干壁及主肺動脈隔之間。胚胎發(fā)育第10天始，ISL-1強(qiáng)陽性的前腸腹側(cè)呼吸內(nèi)胚層緊鄰動脈囊背側(cè)壁內(nèi)皮，局部增厚，形成突向動脈囊腔的內(nèi)胚層突起。發(fā)育至11天后，前腸腹側(cè)份ISL-1陽性內(nèi)胚層增生活躍，上皮細(xì)胞層數(shù)明顯增加，并向動脈囊方向生長，形成實(shí)心內(nèi)胚層細(xì)胞索。圍繞增生的前腸腹側(cè)呼吸內(nèi)胚層及內(nèi)胚層細(xì)胞索，ISL-1陽性間充質(zhì)細(xì)胞聚集，形成特征性ISL-1陽性錐體形結(jié)構(gòu)。隨發(fā)育，內(nèi)胚層細(xì)胞索伸長，ISL-1陽性錐體形

11、結(jié)構(gòu)的尖端逐漸生長入動脈囊腔，并與流出道心內(nèi)膜墊融合，將流出道遠(yuǎn)端分隔為心包內(nèi)升主動脈和肺動脈干。胚齡11天，有些部位增厚的內(nèi)胚層出現(xiàn)細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞分散，細(xì)胞大小不等，呈現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，與周圍ISL-1陽性間充質(zhì)細(xì)胞無明確界限。因此，我們認(rèn)為:ISL-1同時是第一、第二生心區(qū)心肌前體細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。第一生心區(qū)和第二生心區(qū)是連續(xù)結(jié)構(gòu)，原始心管的形成與第二生心區(qū)向發(fā)育中心管添加心肌細(xì)胞是連續(xù)的發(fā)育過程。第二生心區(qū)IS

12、L-1陽性細(xì)胞于胚齡10天前，向心肌細(xì)胞分化，11天后，向動脈囊壁平滑肌方向分化。胚齡11天后，前腸腹側(cè)ISL-1陽性錐體形結(jié)構(gòu)參與動脈囊壁、主肺動脈隔及心包內(nèi)升主動脈干和肺動脈干壁的形成。胚齡10天始，前腸腹側(cè)呼吸內(nèi)胚層細(xì)胞的增生和細(xì)胞索的形成可能誘導(dǎo)第二生心區(qū)的擴(kuò)展，形成特征性ISL-1陽性錐體形結(jié)構(gòu)。前腸腹側(cè)呼吸內(nèi)胚層細(xì)胞在增生過程中失去極性，可能通過上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，形成ISL-1陽性錐體形結(jié)構(gòu)中的間充質(zhì)細(xì)胞，保持第二生心區(qū)細(xì)胞

13、數(shù)量穩(wěn)定，流出道的分隔和前腸呼吸內(nèi)胚層的發(fā)育密切相關(guān)。
　　 第二部分:
　　 轉(zhuǎn)錄因子GATA4的表達(dá)與小鼠胚胎心動脈端的發(fā)育
　　 用抗GATA4、抗Nkx2.5、抗轉(zhuǎn)錄因子胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(ISL-1)、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和抗心肌肌球蛋白重鏈(MHC)抗體對胚齡7.5～13天小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)PAP法或免疫熒光染色。WesternBlotting檢測GATA4與磷酸化組

14、蛋白H3(PHH3)在胚齡11～14天小鼠胚胎心的表達(dá)。結(jié)果顯示:GATA4和Nkx2.5蛋白在小鼠胚胎7.5天同時表達(dá)于生心板，早于MHC的表達(dá)，胚齡8.5～10天，GATA4和Nkx2.5進(jìn)一步表達(dá)于心包腔背側(cè)壁第二生心區(qū)的臟壁中胚層，胚齡11天～l3天，兩者的表達(dá)從流出道與心包腔背側(cè)壁交界處降至主肺動脈根部，流出道心內(nèi)膜（墊）間充質(zhì)中可見GATA4陽性細(xì)胞。胚齡11～13天，GATA4見于前腸內(nèi)胚層，ISL-1陽性間充質(zhì)細(xì)胞圍繞前

15、腸腹側(cè)GATA4陽性的呼吸內(nèi)胚層及內(nèi)胚層細(xì)胞索分布，可見少量GATA4陽性細(xì)胞延伸至前腸內(nèi)胚層周圍的間充質(zhì)中。GATA4與磷酸化組蛋白H3(PHH3)的表達(dá)高峰見于胚齡11～13天，胚齡14天GATA4與PHH3顯著減少。因此，我們認(rèn)為:小鼠胚胎發(fā)育早期，GATA4與Nkx2.5在生心區(qū)的表達(dá)模式相同，GATA4可能促進(jìn)心肌細(xì)胞增生，前腸內(nèi)胚層的GATA4可能參與第二生心區(qū)的發(fā)育。GATA4在小鼠胚胎心發(fā)育過程中有獨(dú)特的時空分布，GAT