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1、胚胎早期單管狀心臟流出道連于動(dòng)脈囊和原始心室之間。隨發(fā)育,流出道經(jīng)復(fù)雜的分隔和結(jié)構(gòu)重建,參與心包內(nèi)主、肺動(dòng)脈與所屬動(dòng)脈瓣膜以及左右心室流出道的發(fā)育。有關(guān)不同種屬動(dòng)物胚胎心臟流出道發(fā)育和分隔機(jī)理已有大量研究,但目前尚有許多爭(zhēng)議。探討胚胎早期心臟流出道的正常發(fā)育和分隔機(jī)理可以為流出道發(fā)育和分隔異常導(dǎo)致的先天性心臟病的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)。 心臟神經(jīng)嵴是指從耳板中部到第3對(duì)體節(jié)之間的神經(jīng)嵴細(xì)胞,遷移進(jìn)入胚胎心臟,參與主肺動(dòng)脈隔、流出道
2、心內(nèi)膜墊的形成與流出道的分隔。遷移前去除心臟神經(jīng)嵴,可表現(xiàn)為永久性動(dòng)脈干等畸形。因此,有關(guān)神經(jīng)嵴細(xì)胞在流出道的分布與功能成為研究焦點(diǎn)之一,但由于種屬差異和實(shí)驗(yàn)方法不同,對(duì)心臟神經(jīng)嵴在流出道分隔中的作用仍存在分歧。 流出道嵴融合形成間充質(zhì)性流出道隔與其肌性化相伴隨,間充質(zhì)組織肌性化的機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為流出道壁心肌細(xì)胞不斷向隔內(nèi)生長,同時(shí)募集相鄰間充質(zhì)細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化共同完成流出道隔的肌性化。而本課題組觀察到流出道嵴及其融
3、合形成的流出道隔內(nèi)存在間充質(zhì)細(xì)胞的原位分化。因此,流出道心肌性隔的形成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)通過觀察α—平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—SMA)、α—橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α—SCA)、肌球蛋白重鏈(MHC)在C10期~C19期人胚心臟的表達(dá)規(guī)律,探討流出道嵴、主肺動(dòng)脈隔的形成與動(dòng)脈囊、心肌性流出道的分隔過程;闡明α—SMA.在流出道心肌與心內(nèi)膜墊內(nèi)的表達(dá)規(guī)律及其意義。通過觀察胚齡10~14d小鼠胚胎心臟流出道內(nèi)PlexinA2、α—S
4、MA陽性細(xì)胞分布規(guī)律與流出道嵴內(nèi)致密細(xì)胞團(tuán)融合過程中間充質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,探討PlexinA2、α—SMA時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)及其對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。通過觀察胚齡12~16d小鼠胚胎心臟流出道心肌性隔的形成過程,探討流出道心肌性隔的形成機(jī)制。 第一章、人胚早期心臟流出道的分隔。 對(duì)32例C10期~C19期[Carnegie stage 10~Carnegie stage19,Carnegie分期法,排卵后(22±1~4
5、7)d]人胚心臟連續(xù)切片,經(jīng)抗α—平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—smooth muscle actin,α—SMA)、抗α—橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α—sarcomeric actin,α—SCA)、抗肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)抗體免疫組織化學(xué)染色,觀察進(jìn)入流出道嵴的α—SMA陽性細(xì)胞的遷移路線、動(dòng)脈囊的演變及其與心肌性流出道的分隔過程。結(jié)果顯示:人胚C10期~C13期,動(dòng)脈囊位于心包腔外,與心肌性流出道的界限位于流
6、出道與心包腔背側(cè)壁反折處;人胚C14期~C15期,第4弓動(dòng)脈以下的動(dòng)脈囊逐漸降入心包腔內(nèi),動(dòng)脈囊壁心肌化成為流出道的遠(yuǎn)端,使心肌性流出道增長;人胚C16期,第4弓動(dòng)脈水平的動(dòng)脈囊也降入心包腔內(nèi),但未發(fā)生心肌化,動(dòng)脈囊與心肌性流出道界限移至心包腔內(nèi)。人胚C12期~C15期,α—SMA陽性細(xì)胞逐漸在流出道心內(nèi)膜墊聚集,參與形成螺旋狀流出道嵴;C16期,α—SMA陽性主肺動(dòng)脈隔形成,流出道嵴縮短。人胚C14期,心包腔外的動(dòng)脈囊分隔。人胚C16
7、期,進(jìn)入心包內(nèi)的動(dòng)脈囊分隔為心包內(nèi)升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈干,心肌性流出道遠(yuǎn)端可見兩動(dòng)脈瓣膜原基,流出道嵴尚未融合。人胚C19期,瓣膜水平流出道嵴開始融合形成流出道隔,分隔心肌性流出道,來自兩側(cè)嵴內(nèi)α—SMA陽性細(xì)胞在隔中央聚集。由此本文認(rèn)為:流出道嵴的形成早于主肺動(dòng)脈隔的出現(xiàn),流出道嵴的遠(yuǎn)端、近端界限與心肌性流出道的遠(yuǎn)端、近端界限始終保持一致。動(dòng)脈囊首先在心包腔外分隔,進(jìn)入心包腔后由主肺動(dòng)脈隔分隔形成心包內(nèi)升主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈干,流出道嵴遠(yuǎn)端形成
8、兩動(dòng)脈瓣膜。流出道嵴大部融合分隔瓣膜以下的心肌性流出道。 第二章、人胚早期心臟流出道內(nèi)α—SMA陽性細(xì)胞的發(fā)育。 用抗α—平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—SMA)、抗α—橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α—SCA)、抗肌球蛋白重鏈(MHC)抗體對(duì)29例C10期~C16期[Carnegie stage 10~Carnegie stage 16,排卵后(22±1~37)d]人胚心臟連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示:人胚發(fā)育C10期~C13期,
9、與流出道反折處的心包腔背側(cè)壁中胚層上皮細(xì)胞部分呈α—SMA陽性,而α—SCA和MHC表達(dá)較弱。提示心包腔背側(cè)壁上皮不斷分化為心肌細(xì)胞添加至流出道遠(yuǎn)端使其增長,這些心肌細(xì)胞α—SMA的表達(dá)早于α—SCA和MHC。人胚C14期~C15期,進(jìn)入心包腔的動(dòng)脈囊壁α—SMA染色為強(qiáng)陽性,而α—SCA和MHC僅在左側(cè)壁表達(dá)較強(qiáng)。提示動(dòng)脈囊壁正在心肌化。人胚C12期~C15期,α—SMA陽性細(xì)胞由咽部間充質(zhì)逐漸遷入流出道心內(nèi)膜墊內(nèi),同時(shí)可見流出道心內(nèi)
10、膜的部分內(nèi)皮細(xì)胞由α—SMA陰性轉(zhuǎn)為陽性,向間充質(zhì)細(xì)胞分化。不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞在流出道心內(nèi)膜墊內(nèi)聚集,參與形成流出道嵴。隨著α—SMA陽性細(xì)胞不斷進(jìn)入,流出道嵴體積逐漸增大。人胚C16期,流出道嵴縮短,嵴內(nèi)大部分間充質(zhì)細(xì)胞α—SMA表達(dá)減弱,而在流出道嵴近心肌處出現(xiàn)成行排列的α—SMA強(qiáng)陽性細(xì)胞,相鄰的心肌細(xì)胞伸出突起與其相連。由此本文認(rèn)為:α—SMA可作為心肌細(xì)胞早期分化的標(biāo)志;流出道嵴表面內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)α—SMA;
11、主肺動(dòng)脈隔與流出道嵴內(nèi)的α—SMA陽性細(xì)胞參與動(dòng)脈囊分隔。 第三章、小鼠胚胎心臟流出道嵴的發(fā)育。 用抗α—平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—SMA)、抗α—橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α—SCA)單克隆抗體對(duì)胚齡10~14d小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色;用原位雜交方法顯示PlexinA2陽性細(xì)胞向胚齡10~14d小鼠胚胎流出道的遷移與分布;透射電鏡觀察胚齡12.5d心臟流出道嵴融合過程。結(jié)果顯示:胚齡10~11d,神經(jīng)管及其周圍、
12、動(dòng)脈囊和弓動(dòng)脈壁可見PlexinA2陽性細(xì)胞,并沿動(dòng)脈囊壁遷入流出道嵴內(nèi),部分細(xì)胞同時(shí)表達(dá)α—SMA。胚齡12d,PlexinA2陽性細(xì)胞分布在脊神經(jīng)節(jié)、咽前間充質(zhì)、主肺動(dòng)脈隔以及主、肺動(dòng)脈壁。主肺動(dòng)脈隔顯α—SMA強(qiáng)陽性,但動(dòng)脈壁僅見少量α—SMA陽性細(xì)胞。胚齡12.5d,兩側(cè)流出道嵴內(nèi)致密間充質(zhì)細(xì)胞團(tuán)形成,并在瓣膜水平開始融合,PleinA2表達(dá)較弱,α—SMA表達(dá)呈強(qiáng)陽性。在流出道嵴融合開始后,嵴表面的內(nèi)皮細(xì)胞帶形成繼而斷裂消失,
13、由含微絲少、排列稀疏的間充質(zhì)細(xì)胞取代。兩側(cè)致密細(xì)胞團(tuán)逐漸靠攏、融合。有的間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含較多線粒體和微絲,細(xì)胞之間形成細(xì)胞連接點(diǎn);有的間充質(zhì)細(xì)胞含微絲少,細(xì)胞膜間斷融合。還可見內(nèi)皮細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞融合形成雙核細(xì)胞。由上述結(jié)果可得出以下結(jié)論:流出道心內(nèi)膜墊內(nèi)α—SMA陽性間充質(zhì)細(xì)胞來自神經(jīng)嵴;內(nèi)皮細(xì)胞—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化參與流出道嵴融合;致密細(xì)胞團(tuán)內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞富含微絲束和細(xì)胞連接點(diǎn)或發(fā)生細(xì)胞膜局部融合,增加了細(xì)胞之間連接的牢固性,有助于流出道嵴
14、的融合;PlexinA2表達(dá)減弱可能有助于間充質(zhì)細(xì)胞的粘附與聚集。 第四章、小鼠胚胎心臟流出道間充質(zhì)隔的肌性化。 用抗α—平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—SMA)、抗結(jié)蛋白(Desmin)、抗α—橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α—SCA)單克隆抗體對(duì)胚齡12~16d小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進(jìn)行染色。用TUNEL染色對(duì)胚齡13~15d小鼠胚胎心臟切片進(jìn)行染色。結(jié)果顯示:胚齡12d,小鼠胚胎心臟流出道嵴尚未融合,一側(cè)嵴內(nèi)觀察到少量α—SMA、Desm
15、in、α—SCA陽性的心肌細(xì)胞,并可見流出道壁心肌細(xì)胞開始向嵴內(nèi)延伸。胚齡12.5~14d,動(dòng)脈瓣膜及其以下流出道嵴融合形成間充質(zhì)性流出道隔。流出道壁α—SCA陽性的心肌細(xì)胞進(jìn)一步向間充質(zhì)隔內(nèi)長入。隔中央可見α—SMA、α—SCA陽性細(xì)胞獨(dú)立存在。胚齡13~15d,流出道隔中央可見α—SMA陽性細(xì)胞聚集形成漩渦狀結(jié)構(gòu),隔內(nèi)更多間充質(zhì)細(xì)胞由心肌細(xì)胞取代,僅在其中央呈α—SCA陰性。胚齡16d流出道心肌性隔形成。胚齡13~15d,間充質(zhì)隔中
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