Galpha13信號(hào)通路與Cx43基因敲除胎鼠心臟近端流出道隔心肌化過(guò)程的關(guān)系.pdf

1、心臟錐干部畸形是常見(jiàn)的復(fù)雜性先天性心臟病(先心病)，是導(dǎo)致兒童死亡的主要原因之一。近端流出道隔對(duì)錐干部的發(fā)育至關(guān)重要。細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)基因敲除(Cx43KO)小鼠心臟錐干部發(fā)育畸形，流出道梗阻，生后即出現(xiàn)死亡，表明Cx43在心臟流出道發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。Cx43是連接蛋白家族中的重要一員，作為一種重要的通訊連接，是細(xì)胞間代謝偶聯(lián)、沖動(dòng)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)Cx43KO小鼠心臟近端

2、流出道隔心肌化過(guò)程異常，提示復(fù)雜的分子機(jī)制參與心臟流出道梗阻的發(fā)生。為此，本課題擬研究Cx43KO小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變，篩選可能導(dǎo)致Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的相關(guān)基因，進(jìn)一步闡述Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的發(fā)病機(jī)制。 第一部分 Cx43基因敲除小鼠心臟發(fā)育心肌化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)研究研究 目的：利用Cx43基因敲除小鼠模型，探討Cx43基因敲除小鼠與野生型小鼠在心臟心肌化發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)差

3、異。 材料與方法： 成年2月齡Cx43基因敲除雜合子小鼠交配，選取ED11.5～ED15.5天的胎鼠以及新生小鼠為研究對(duì)象，根據(jù)基因型分為Cx43基因敲除純合子(Cx43-/-)、雜合子(Cx43+/-)及野生型(Cx43+/+)，采用PCR方法鑒定基因型。顯微解剖及HE染色觀察心臟結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)法測(cè)定橫紋肌肌動(dòng)蛋白α-SCA的表達(dá)。 結(jié)果： 1．所有Cx43-/-小鼠出生后很快死亡，其心臟大體解剖上

4、可見(jiàn)右室流出道圓錐部明顯膨出。Cx43+/-新生鼠心臟無(wú)明顯異常。 2．組織切片HE染色顯示，出生后很快死亡的Cx43-/-小鼠右室流出道圓錐部組織異常增生，小梁間囊明顯，結(jié)構(gòu)排列紊亂，流出道腔縮窄，右室壁心肌致密層的厚度較野生型明顯變薄。Cx43+/-新生鼠心臟無(wú)明顯異常。 3．野生型胎鼠心臟近端流出道心內(nèi)膜墊組織于ED11.5天開(kāi)始有融合趨勢(shì)，ED13.5天完成融合；心肌化過(guò)程從ED12.5天開(kāi)始，ED15.5天完成

5、。整個(gè)心肌化過(guò)程呈現(xiàn)心肌由流出道隔外側(cè)向內(nèi)側(cè)的生長(zhǎng)趨勢(shì)。而在Cx43-/-胎鼠，α-SCA在近端流出道隔心內(nèi)膜墊組織的表達(dá)減少，尤其是在ED13.5～ED15.5天為著，說(shuō)明心肌化過(guò)程延遲。Cx43+/-的變化不明顯。 小結(jié)： 1．Cx43-/-小鼠以右室流出道異常增生引起的梗阻性畸形為主要表型特征。 2．Cx43-/-小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯。 第二部分 Cx43基因敲除胎鼠心肌化過(guò)程中心臟流出

6、道組織中基因表達(dá)譜的變化研究 目的： 觀察 Cx43-/-小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變，篩選可能導(dǎo)致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的相關(guān)基因。 材料與方法： 以ED14.5天的Cx3-/-和Cx43+/+胎鼠心臟近端流出道部為研究材料，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；并在體外轉(zhuǎn)錄為cRNA，同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記及片段化；再與Affymetrix 430 2.0基因芯片進(jìn)行雜交。雜交信號(hào)經(jīng)掃

7、描后，應(yīng)用相關(guān)生物信息軟件分析基因表達(dá)情況。對(duì)芯片檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的4個(gè)Galpha13信號(hào)通路上的基因，在 ED11.5～ED15.5期間用Realtime RT-PCR 的方法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1．與Cx43+/+組相比較，Cx43-/-組中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因共有287個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有199個(gè)。其中表達(dá)差異的基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期等主要生理過(guò)程。 2．進(jìn)一步篩查發(fā)現(xiàn)，Galpha13

8、信號(hào)通路上的多個(gè)基因在Cx43-/-組有明顯變化。 3．Realtime RT-PCR驗(yàn)證其中的4個(gè)基因包括RhoA、Rac1、Calm1及Rock-1的變化，表明其變化趨勢(shì)基本與基因芯片結(jié)果相同。 小結(jié) 1．Cx43 基因敲除后可以引起多個(gè)基因的表達(dá)異常，其中包括與流出道發(fā)育密切相關(guān)的一些基因。 2．Cx43-/-胎鼠心臟流出道組織中Galpha13信號(hào)通路RhoA、Rac1、Calm1及Rock-1等

9、基因的差異表達(dá)可能與其流出道梗阻的發(fā)生相關(guān)。 第三部分 Rock-1 在胎鼠心臟流出道隔的表達(dá)規(guī)律及其在Cx43基因敲除胎鼠心臟流出道隔表達(dá)的變化研究 目的：觀察Rho相關(guān)卷曲蛋白激酶Rock-1在小鼠胚胎心臟流出道發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，探討其在胚胎心臟流出道隔心肌化過(guò)程中的作用。 材料與方法： 選用ED11.5至ED15.5天的Cx43+/+和Cx43-/-小鼠，用免疫組織化學(xué)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PC

10、R方法檢測(cè)Rock-1在胚胎不同發(fā)育時(shí)期流出道部位的表達(dá)，比較分析兩組胎鼠心臟流出道組織中該基因表達(dá)的差異。 結(jié)果： 1．Rock-1 蛋白的表達(dá)主要局限在胚胎心臟近端流出道隔組織中，其表達(dá)的部位隨胎齡的變化與α-SCA有類似之處。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法顯示Rock-1基因從ED11.5 即開(kāi)始在流出道組織中表達(dá)，以后在ED13.5～ED14.5表達(dá)量達(dá)到高峰。這與胚胎心臟近端流出道心肌化的高峰時(shí)間吻合。 2．在

11、近端流出道隔心肌化的ED11.5～ED15.5時(shí)期，隨著Cx43-/-組流出道隔心肌化過(guò)程的延遲，免疫組化和Realtime RT-PCR均顯示該組Rock-1的表達(dá)從ED13.5開(kāi)始較Cx43+/+組明顯減少，并持續(xù)至ED15.5天。 小結(jié)： 1． Rock-1 在心臟流出道組織中的時(shí)空表達(dá)模式與以α-SCA標(biāo)記的心肌化過(guò)程極為相似，提示其可能參與了心肌化過(guò)程。 2．Cx43-/-胎鼠Rock-1的表達(dá)量下降可

12、能與其流出道隔的心肌化延遲有關(guān)。 總結(jié)： Cx43基因敲除純合子小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯，提示Cx43在心肌化的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。利用基因芯片技術(shù)初步篩選出與Cx43-/-胎鼠心臟近端流出道發(fā)育畸形有關(guān)的多個(gè)基因，其中Galpha13信號(hào)通路上相關(guān)基因的表達(dá)異常可能與Cx43-/-小鼠流出道梗阻的發(fā)生有關(guān)。而Rock-1基因在心肌化過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，其表達(dá)量的下調(diào)可能是Cx43-/-胎鼠心臟近端流出道