甲狀腺激素干擾物體內(nèi)短期標(biāo)準(zhǔn)化甄別實(shí)驗(yàn)初探.pdf

1、甲狀腺激素干擾物是一類通過影響甲狀腺激素的合成、運(yùn)輸、分解等，從而改變甲狀腺激素的功能和穩(wěn)態(tài)的化學(xué)物質(zhì)。由于甲狀腺激素在體內(nèi)涉及生長、新陳代謝，尤其對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要的影響，因而必須建立有效的甲狀腺激素干擾物的甄別方法。目前，國際上對甲狀腺激素干擾物的甄別方法是分層次進(jìn)行，即首先進(jìn)行初篩，判定某化學(xué)物是否屬于甲狀腺激素干擾物，再進(jìn)行更高層次的鑒定。而初篩實(shí)驗(yàn)要求采取快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)方法。然而，國際上尚未建立符合上述實(shí)驗(yàn)要求的甲狀

2、腺激素干擾物體內(nèi)短期甄別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。 一些研究者認(rèn)為，F(xiàn)T<,4>和TSH濃度的測定，同時加上甲狀腺的組織學(xué)評價可能是有效的甄別方法，并提出實(shí)驗(yàn)期至少需2～6周。顯然，該實(shí)驗(yàn)期過長是建立初篩實(shí)驗(yàn)的重大障礙，解決這一難題的必要條件蹩：在對審狀腺組織形態(tài)學(xué)改變規(guī)律進(jìn)行細(xì)致研究的基礎(chǔ)上，確立穩(wěn)定且出現(xiàn)又早的形態(tài)學(xué)改變作為觀察終點(diǎn)，從而縮短實(shí)驗(yàn)周期，使實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)具有實(shí)際的可操作性。 為達(dá)到該目的，本課題組以丙硫氧嘧啶(PTU)為模型

3、藥物，建立甲狀腺激素干擾物體內(nèi)短期標(biāo)準(zhǔn)化甄別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，擬進(jìn)行以下研究：1．PTU致甲狀腺增生的量效關(guān)系研究；2．PTU致甲狀腺增生的時效關(guān)系研究; 3．PTU致甲狀腺腫的組織發(fā)生學(xué)研究：4．驗(yàn)證并完善PTU為模型藥物的甄別甲狀腺激素干擾物的體內(nèi)短期標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。 本次研究針對的是第1和第2部分。通過對PTU致甲狀腺組織增生的量效關(guān)系的研究，探討PTU劑量設(shè)計的規(guī)律，比較雌、雄動物的敏感性等，為時效關(guān)系的研究提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計依據(jù)；通

4、過對PTU致甲狀腺組織增生的時效關(guān)系的研究，確認(rèn)敏感的實(shí)驗(yàn)觀察終點(diǎn)及其可靠性，探討最佳實(shí)驗(yàn)期，初步建立以PTU為模型的甲狀腺激素干擾物體內(nèi)短期甄別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。在量效關(guān)系研究中，采用健康7周齡清潔級SD大鼠100只，雌雄各半。根據(jù)體重隨機(jī)分為5組，其中4個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組。實(shí)驗(yàn)組的劑量設(shè)為0.04、0.2、1和5mg/(kg.d)，每組20只大鼠，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)組用PTLJ的玉米油溶液灌胃，灌胃體積均為1ml/100g.bw，對照組用相同

5、體積的玉米油灌胃，實(shí)驗(yàn)期為10d。實(shí)驗(yàn)期中觀察體重和攝食量的變化，實(shí)驗(yàn)期末檢測甲狀腺的臟器系數(shù)，HE染色觀察甲狀腺組織的病理學(xué)改變，PAS染色觀察PTU對膠質(zhì)的影響。結(jié)果顯示：包括5mg/(kg.d)組在內(nèi)的各實(shí)驗(yàn)組，無論雌雄，動物的體重，增重，攝食量均無顯著性差異；動物甲狀腺臟器系數(shù)，無論雌雄，均在5mg/(kg.d)組顯著高于對照組；組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，無論雌雄，隨著PTU暴露劑量的增加，甲狀腺濾泡上皮增生范圍不斷擴(kuò)大，在5mg/(kg

6、.d)組，幾乎達(dá)全視野彌漫性增生。而甲狀腺濾泡增生形態(tài)，無論雌雄，在0.04mg/(kg.d)和0.2mg/(kg.d)組，表現(xiàn)為增生斑為主；1mg/(kg.d)組表現(xiàn)為實(shí)心芽為主；而5 mg/(kg.d)組表現(xiàn)為較多的實(shí)心繼發(fā)濾泡和空心繼發(fā)濾泡，除濾泡上皮增生改變外，該劑量組可觀察到間質(zhì)纖維母細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生。PAS染色結(jié)果顯示，無論雌雄，0.04、0.2、1 mg/(kg.d)組甲狀腺濾泡膠質(zhì)染色弱陽性，5mg/(kg.d

7、)組甲狀腺濾泡膠質(zhì)染色為陰性。 結(jié)果提示： 1.體內(nèi)短期甄別實(shí)驗(yàn)的劑量應(yīng)采取動物體重、攝食量無明顯變化的劑量。 2.甲狀腺濾泡的增生規(guī)律可能是復(fù)層化～增生斑～實(shí)心芽～實(shí)心繼發(fā)濾泡～空心繼發(fā)濾泡，而5mg/(kg.d)作為時效關(guān)系研究的劑量是合適的。 3.雌雄動物對PTU致甲狀腺增生反應(yīng)的敏感性相同，在以后的研究中，可以采用單一性別的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 在時效關(guān)系研究中，采用健康7周齡清潔級SD大鼠50

8、只，雄性。根據(jù)體重隨機(jī)分為5組，其中4個實(shí)驗(yàn)組和1個溶劑對照組，實(shí)驗(yàn)組的染毒時間設(shè)為3、6、9、12d，每組10只大鼠。實(shí)驗(yàn)組PTU染毒劑量為5mg/(kg．d)，即以玉米油為溶劑，配制O．5mg/ml的PTU懸浮液，按照1m1/100g．bw的體積進(jìn)行灌胃，對照組用同樣體積的玉米油灌胃。實(shí)驗(yàn)?zāi)┯没瘜W(xué)發(fā)光法測量血清甲狀腺激素(TT<,3>，TT<,4>)和TSH的濃度，檢測甲狀腺的臟器系數(shù)，HE染色觀察甲狀腺組織病理改變，PAS染色觀察

9、PTU對膠質(zhì)的影響，免疫組化法和Western-blot檢測PCNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：3d TT<,2>的濃度就開始明顯下降，直至12d達(dá)最低點(diǎn)，從6 d開始TT<,4>濃度才顯著降低，直至12d達(dá)最低點(diǎn)，TSH濃度也是從6d才開始顯著升高，時至12d，TSH升高到最高點(diǎn)。甲狀腺臟器系數(shù)從6d開始甲狀腺臟器系數(shù)顯著高于對照組，且隨著暴露時間延長有升高的趨勢。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)3d組甲狀腺濾泡上皮復(fù)層化；6d組彌漫性增生，大量增生斑、實(shí)心芽形

10、成；9d組纖維母細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞大量增生，分割實(shí)心芽，大量實(shí)心繼發(fā)濾泡形成；12d組有大量的空心繼發(fā)濾泡形成。PAS染色顯示，3、6、9d組的甲狀腺濾泡膠質(zhì)染色弱陽性，12d組甲狀腺濾泡膠質(zhì)染色陰性。免疫組織化學(xué)檢測的PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)和western-blot檢測的PCNA/β-actin的相對值隨時間變化的規(guī)律完全一致，即3d開始增加；而6d達(dá)到高峰：9d開始減少；12d與對照組相比則無差異。 結(jié)果提示：

11、1．TT<,3>和TT<,4>時至12d仍未代償，且由于血清學(xué)指標(biāo)質(zhì)量難以控制等原因，尚不能以血清甲狀腺激素和TSH濃度的改變作為判斷甲狀腺激素干擾物的唯一依據(jù)； 2．再次證實(shí)PTU致甲狀腺增生的規(guī)律是“復(fù)層化～增生斑～實(shí)心芽～實(shí)心繼發(fā)濾泡～空心繼發(fā)濾泡”，甲狀腺腫的形成可能遵循“增生～分化～再增生～再分化”的規(guī)律； 3．PCNA的隨時間變化規(guī)律是客觀、可靠的，甲狀腺早期增生指標(biāo)增生斑和實(shí)心芽穩(wěn)定而可靠。 4．初